神经生长因子在大鼠弥漫性轴索损伤后对NgR蛋白表达的影响

材料与方法

1.1动物及试剂实验用SPF级SpragueDawley大鼠，雄性，体重250-300g（购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司）。饲养条件：2只/笼，自由进食进水，室温维持25℃左右，12小时光照/黑暗循环。动物随机分为4大组：正常对照组，假手术组，脑损伤（DAI）模型组，DAI后NGF治疗组。各组又分1d组、3d组、7d组、14d组，每组各5只。鼠神经生长因子，18ug/支，厦门北大之路生物工程有限公司生产，18ug以2ml生理盐水配制，治疗组大鼠均每日按1ml/kg肌注1次；所有二抗、ABC和DAB试剂盒购自美国Vector公司。

1.2实验方法

1.2.1DAI模型制备：采用MarmarouA等[3]的方法。称重，腹腔注射10%水合氯醛（4ml/kg）麻醉大鼠，头顶部备皮，切开皮肤，分离各层组织，暴露颅骨项部位于冠状缝和人字缝之间的颅骨穹隆处，将一直径为lcm的不锈钢垫片固定于人字缝之前，待大鼠意识状态基本恢复正常后行头部撞击。将大鼠俯卧固定于致伤装置的海绵床上。保证大鼠头部位置端正，并使垫片的中央正对致伤装置有机玻璃管的下口。重锤（钢质，50g）从指定的高处（1.5m）自由下落致圆盘形的垫片上，海绵床连同大鼠要在打击后迅速撤离引导管下方以确保是单次打击。检查颅骨项部是否有骨折发生，缝合头皮。弃除撞击后死亡的大鼠以及颅骨发生骨折的大鼠，选取打击后动物立即出现昏迷（惊吓反射、角膜反射、痛觉反射消失），且昏迷时间长于3～5min，作为模型。假手术组的大鼠进行同样的撞击前的手术及准备，但不予以致伤。

1.2.2DAI后NGF治疗组制备：DAI造模成功后，治疗组大鼠均每日按1ml/kg肌注鼠神经生长因子1次，注射部位为大腿后侧肌肉。

1.2.3组织切片制备：致伤后按实验设计时间点10%水合氯醛麻醉大鼠，以O.9%生理盐水（200～300m1）行心腔灌注冲洗后，用多聚甲醛灌注固定液（约350m1）灌注固定，迅速断头取全脑，置于4%多聚甲醛固定液中后固定24h。组织块经脱水、透明、石蜡包埋成块。石蜡切片机水平面进行连续的组织切片，切片厚度为4μm，经展片后使用载玻片捞取切片烤干备用。

1.2.4免疫组织化学染色：取脱蜡切片投入PBS缓冲液，经抗原修复液95°C存放20min，缓冲液清洗2次，再入0.3%H2O2溶液内室温20min，以消除内源性过氧化物酶。然后，切片孵育在2%小牛血清溶液中1小时，以减少非特异性反应。一抗NogoR经1%小牛血清与0.15%TritonX100缓冲液配制。每片滴加100μlNogoR（1：200）抗体中孵育4°C过夜，次日经缓冲液洗涤3次后，加相应抗兔二抗（1：400）溶液，室温孵育1小时，缓冲液洗涤3次后，加生物素与卵白素结合（ABC）试剂盒配置的混合液中培育1小时。底物呈色反应剂采用DAB。呈色反应后，切片经逐级脱水并中性树脂封片。每例标本测5张切片，取被检各区之均值。显微镜观察拍照。

1.3图像分析：在日本产NikonEclipse80i显微镜下观察结果，并用NikonDS高分辨率数码像机经NIS-ElementsAR3.0软件拍照。对每个组织切片均通过拍照收集全组织切面图像。结果分析，采用Ver.3.00程序软件作图像数字采集及半定量分析。

1.4统计学处理：实验数据以X±s表示，治疗前后均数的比较采用配对t检验。用SPSS13软件包进行处理。以P<0.05有统计学意义。

2结果

2.1一般情况：存活大鼠打击后多数即刻昏迷，呼吸暂停数秒至数十秒不等，自主呼吸恢复后呼吸由慢转快，有的还可见张口呼吸、尖叫、呻吟等反应。多数大鼠出现了持续15～30s甚至更长时间的全身痉挛，还有部分大鼠在昏迷期间出现了角弓反张、前肢屈曲等状态。苏醒后存活的大鼠以上症状会逐渐好转，但普遍出现反应迟钝、活动和进食减少的现象，也有严重者会遗留前肢肌力下降、偏瘫、肠梗阻或肠穿孔等症状，约有70%以上的大鼠打击后存活。

2.2免疫组化染色：NgR阳性细胞主要分布于大脑皮层、皮层下、海马、下丘脑等处，其中在大脑皮层与海马相连部位的少突胶质细胞有很强的免疫阳性反应。NgR免疫反应阳性少突胶质细胞主要为椭圆形，可有明显的突起。实验选取大脑皮层与海马CA1区之间部位中阴性和阳性计数后计算阳性率。如表1所示：致伤后1天，NgR表达轻度下降；到第3天，轴索的NgR表达则有较明显下降（P<0.05）；到致伤后第7天，轴索的NgR表达恢复至正常时水平；进展至致伤的第14天，NgR表达有较明显的升高。NGF治疗组在每个时间段的NgR表达水平均明显较DAI模型组低（P<0.05）。

3讨论

颅脑损伤后高致残率和死亡率的原因很大程度上要归于中枢神经系统（CNS）再生障碍。在CNS的再生修复过程中，神经抑制因素被认为占据优势。CNS环境中的抑制作用主要来源于两方面：胶质瘢痕和髓鞘，后者是由少突胶质细胞形成。髓鞘相关蛋白（MAG）、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（OMgp）及Nogo蛋白是三种主要的髓鞘蛋白，是目前发现的对中枢神经再生起抑制作用的主要物质。它们通过与Nogo66受体（NgR）结合靶动一系列再生抑制进程。NgR通过与上述三种髓磷脂相关蛋白结合，接受来自这些抑制分子的抑制信号，是三种髓磷脂相关蛋白的作用焦点。通过NgR受体复合物的介导，细胞内的RhoA信号通路被激活，最终导致神经元轴突生长锥的溃变，阻断轴突的再生[4]。由于NgR在轴突再生抑制信号的胞内外传导途径中起着枢纽作用，在NgR这一环节阻断抑制信号的传导可以促进中枢神经的再生。

神经生长因子（NGF）遍布于神经元的胞体、胞质和突起，也广泛分布于神经系统和非神经系统的组织和器官。NGF其在中枢神经系统作用主要表现为以下几个方面：①在神经系统的发育过程中主要表现为促进神经元的分化、诱导神经纤维定向生长、控制神经元存活的数量、刺激胞体和树突的发育以及影响神经纤维支配靶区的密度。②在损伤的神经元其作用主要表现在保护神经元、促进神经元修复、抗神经元凋亡以及促进神经纤维再生，减少受损神经细胞的死亡和调控受损神经元的基因表达，促进效应神经元功能的修复，通过受体介导细胞内信号传导，激活各种分化因子，发挥神经趋化作用，引导和加快轴突再生长[5]。

本次研究发现NgR蛋白在致伤后1天稍有下降，第3天明显下降，第7天恢复近正常水平，14天后又明显升高。上述结果说明DAI诱导脑组织的NgR蛋白水平下降，从而降低Nogo-A及其他髓鞘生长抑制物的作用，为再生修复创造有利条件，但这种自身机体的下调持续时间显然并不够长久，还不足以维持到损伤轴索的完全修复。应用NGF治疗的组别，其NgR的表达较模型组受到明显的抑制。本研究结果表明，在DAI早期应用NGF，可以抑制脑组织中NgR蛋白的表达，促进受损神经的再生及修复。其作用机制可能是NGF可以通过介导神经细胞内Nogo抗体信号的传导，阻断Nogo、MAG及Omgp与NgR的结合，拮抗Nogo蛋白等抑制中枢神经元轴突再生及诱导轴突生长锥溃变作用，由此可能在促进中枢神经损伤后的神经再生修复中起到重要作用。

参考文献

[1]王正国。21世纪的创伤研究。中华创伤杂志，2001，17：5-6.

[2]江基尧，朱诚。现代颅脑损伤学。第1版。上海：第二军医大学出版社，1999，215-222.

[3]MarmarouA，FodaM，VandenbrinkWjeta1.Anewmodelofdiffusebraininjuryiats.PathophusiologyandiomechanicsNeurosurg，1994，80（24）：291～300.

[4]ParkJB，YiuG，KanekoS，etal.ATNFreceptorfamilymember，TROY，isacoreceptorwithNogoreceptorinmediatingtheinhibitoryactivityofmyelininhibitors[J].Neuron，2005，45：345-351.

[5]ValdezG，AkmentinW，PhilippidouP.KuruvillaR，GintyDD，HalegouaS.Pincher-mediatedmacroendocytosisunderliesretrogradesignalingbyneurotrphieceptors.JNeurosci2005；25：5236-47.

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