中国人群运动性猝死相关基因快速检测方法研究

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摘要：目的 建立一种中国人群运动性猝死相关基因多态性速测方法。方法 用Chelex法提取外周静脉血基因组DNA，应用定点突变技术获得运动性猝死相关基因的突变阳性DNA模板，然后通过等位基因特异性（allele-specific， AS）PCR法扩增目的基因。优化内参引物、多态引物的Tm值，引物浓度比例，PCR循环数等扩增条件；琼脂糖凝胶电泳进行基因分型。结果 AS-PCR可检测运动性猝死相关基因多态性，PCR产物琼脂糖凝胶分型与DNA测序结果完全一致。结论 本研究建立的AS-PCR方法适用于中国人群运动性猝死相关基因的快速检测。

关键词：运动性猝死；基因多态性；等位基因特异性PCR

中图分类号：G804.83

Abstract：Objective To establish a simple method for testing exercise sudden death gene of Chinese. Methods Firstly， extract genomic DNA from peripheral venous blood. Secondly， use fixed point mutation technique to get the positive template， and then use the allele specific （allele specific， AS） PCR to amply the target gene. Thirdly， optimize the Tm value and concentration ratio of primers， PCR cycle number and a series of amplification conditions. Finally， analyze the PCR product by agarose gel electrophoresis and sequencing. Results The AS-PCR can detect sudden cardiac death gene polymorphism， the agarose gel electrophoresis genotyping results of PCR product coincide exactly with the result of DNA sequencing .Conclusion This new method established and optimized can be used for rapid detection of exercise sudden death related genes.

Key words：Exercise sudden death；Genetic polymorphism；Allele specific PCR

近年来，高强度竞技体育运动项目（如足球、马拉松）运动性猝死案例频发，并且其数量呈逐年上升的态势。目前，临床对运动性猝死的常规检测手段主要有家族史、个人史筛查，体格及心电图检查，若为阳性结果，则进一步查超声心动图、运动负荷试验和24h动态心电图等[1]。但这些检测方法针对性不强，检出率低，具有较大的局限性。国内外对运动性猝死的研究表明[2]，死者的某些基因存在突变，大多表现为SNP或碱基缺失多态性。

在离子通道基因突变导致运动性猝死方面的研究，国内外均有相关报道，并初步确定了运动性猝死相关基因及其突变位点[3]。钠离子通道是一种跨膜糖蛋白，位于细胞质膜上， 由A、B亚单位组成，主要选择性允许钠离子通过， 维持细胞兴奋性及其传导[4]。编码钠离子通道的基因突变会导致其相应的通道蛋白结构与功能异常， 从而引发一类心律失常疾病[5]。钾离子通道是亚型最多、作用最复杂的一类离子通道。编码钾离子通道的基因突变导致的钾通道功能异常可以导致多种心律失常综合症[6]。国内外文献报道研究较多的钾离子通道基因有KCNE1，KCNH2，KCNJ11。KCNE1基因编码人类心肌缓慢激活的延迟整流性钾通道蛋白的B亚单位，该通道在心肌动作电位复极期起重要作用[7]。有文献报道[8]，中国汉族人群中广泛存在KCNE1-S38G 多态性改变，KCNE1—38S 型可能与室性心动过速发病相关。Jeron等[9]发现在AMI并发猝死患者的KCNJ11基因上出现2个错义突变（ P266T和R371H）， 这2个突变导致了氨基酸序列的改变， 诱发折返性心律失常。CACNA1C和CACNB2B是编码钙离子通道的基因，体外实验证明这两个基因的突变导致L型钙通道功能获得性突变， QT间期延长，从而诱发心律失常[10]。NUP155是编码核孔复合物组分的基因，主要控制mRNA由细胞核到细胞质的转运，能够对其他很多基因和蛋白质的表达进行调控，研究表明[11]，NUP155基因的一些细微改变，有可能增加常见的散发性房颤发生的危险性。本研究选取KCNH2、KCNE1、SCN5A、KCNJ11、NUP155、CACNA1C、CACNB2b，7个与运动性猝死显著相关的热点突变基因的多态位点作为靶点，以AS-PCR方法为检测手段，从而建立准确、快速筛查运动性猝死基因多态性的方法。

1 资料与方法

1.1主要试剂及仪器 Chelex-100购自上海生物工程公司；定点突变试剂盒MutanBEST Kit ，PMD18—TVector，PCR扩增试剂包括TaKaRa Taq Hot Start DNA热启动Taq酶，dNTPs，Buff以及核酸电泳分析试剂DL1000 DNA分子量标准，DNA无毒染料，琼脂糖，均购自日本Takara公司；Bigdye3.1DAN测序试剂盒，购自美国Life公司。主要仪器设备有：美国ABI9700型PCR扩增仪，英国UVR电泳凝胶成像系统，美国ABI3130型DNA测序仪。

1.2基因组DNA提取 50例猝死个体临床血液样本，采用Chelex基因组DNA 提取试剂盒， 参照使用说明书操作， 提取基因组DNA。取直径3～5mm血斑置于1.5ml离心管中，加入sdH2O1ml，振荡离心，弃上清，重复步骤2次，弃上清，将5%Chelex-100振荡悬浮后快速用剪掉头的枪头吸取200μl 加入离心管中，振荡数秒，于56℃水浴保温30min后，振荡数秒，95℃沸水浴10min，轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清为提取的DNA，-20℃保存备用。1.3阳性模板制备 根据7个靶基因SNP位点设计突变引物，并进行PCR扩增，将引入突变位点的目的片段克隆到pMD18-TVector载体中（利用Takara MutanBest Kit对PCR产物进行末端平滑化及5′磷酸（P）化处理，高效连接试剂Ligation Solution I进行自身连接，然后转化、提取携带突变位点的质粒DNA），测序验证后作为后续PCR的DNA模板。

1.4 AS-PCR引物设计 根据Genbank中的靶基因序列和AS-PCR原理，采用primer premier 5软件设计多态引物及内参引物，针对变异位点设计一对等位基因特异性引物（AS引物），其3′末端分别与变异位点的碱基互补。为增加扩增特异性和检测分辨率，在3′端第2 位引入错配碱基的AS-PCR引物。同时为排除PCR反应系统敏感性所致基因型判断失误， 在AS 引物上游设计了内参引物PF，下游共用引物PR与其中一种AS 引物用作突变检测。内参引物与下游共用引物扩增较大的片段作为PCR 的质控参照。AS-PCR引物设计原理示意图如图1。

图1 AS-PCR引物设计原理示意图

本实验采用半巢式PCR的方法进行扩增，SNP多态引物及内参引物序列如表1所示。

表1 心源性猝死相关基因AS-PCR引物序列

基因名称 序列 注释

KCNE1 5"-GTGCCTGGGAAGTTTGAGC-3" F

5"-GCAGGTCCCCCCGCAGAA-3" P

5"-GCAGGTCCCCCCGCAGAG-3" P

5"-CCGTTCTTTCCCAGTCTCAT-3" R

KCNH2 5"-GCCGTGCTGTTCTTGCTC-3" F

5"-AGGACAAGTATGTGACGGCTC-3" P

5"-AGGACAAGTATGTGACGGCTT-3" P

5"-GATTGGGGATCTGGTGGAA-3" R

SCN5A 5"-ACAGTGATGCTGGCTGGAAG-3" F

5"-GAAGTACTTCTTCTCCCCGTC-3" P

5"-GAAGTACTTCTTCTCCCCGTT-3" P

5"-ATGTTGATGAGGCTTATCTGGTT-3" R

KCNJ11 5"-CTCATCGTGCAGAACATCGTG-3" F

5"-CGCAAGAGCATGATCATCCA-3" P

5"-CGCAAGAGCATGATCATCCG-3" P

5"-TGGCCGGGCTACATACCA-3" R

CACNA1C 5"-GCCTGCAATAGCTTGAAATAAGG-3" F

5"-GGTGGGGATGTGCTCAGGTA-3" P

5"-GTGGGGATGTGCTCAGGTG-3" P

5"-AGAAGGGAAAGAAGGGAATGAG-3" R

CACNB2B 5"-GCACTTGCTCTGGGACAT-3" F

5"-CCCAGCACCGCTCTTCCGC-3" P

5"-TCCCAGCACCGCTCTTCCGT-3" P

5"-TGATTCTGGCTTGTTGGATA-3" R

NUP155 5"-GGAGAATCGCTTGAACCC-3" F

5"-CTGACGCTGGTTCATGTCAA-3" P

5"-CTGACGCTGGTTCATGTCAG-3" P

5"-TATTGCGTGGTGCTAAGGTT-3" R

注：F为上游引物；P为多态引物；R为下游引物

1.5AS-PCR 反应及条件优化

1.5.1 AS-PCR反应 本实验的反应条件为95℃、3min，94℃、30s，55～65℃、30s，72℃、30s；72℃、3min，共35个循环。PCR缓冲液（其中，Tris-HClpH8.3，100mM；KCl，500，Mm； MgCl2，15mM），dNTPs混合物的各组分浓度为2.5mM，热启动Taq酶（Taq HS）为5U/μl，内参上游引物的浓度为10uM，多态性引物的浓度为10uM，下游引物的浓度为10uM。

1.5.2温度梯度PCR优化退火温度 平行进行56管反应， 设定温度梯度范围为55～65℃， 各管的退火温度分别为：55.0、56.3、57.6、59.1、60.7、62.2、63.8、65.0。反应条件同上，反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪观察，选择无非特异条带，特异性条带最亮的管所对应退火温度为后续反应的退火温度。

1.5.3引物浓度优化 本实验采用半巢式PCR的方法进行扩增，因此存在PCR竞争的情况。将内参引物与目的基因引物的比例进行引物浓度优化。反应产物经用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离， 凝胶成像仪观察， 选择内参条带与目的条带亮度比例适中，便于判读的引物比例为后续反应的引物浓度。

1.5.4 DNA测序验证AS-PCR扩增产物 为了进一步验证采用一系列AS-PCR扩增条件优化后的产物多态性的准确性，通过PCR产物琼脂糖凝胶回收试剂盒将扩增产物回收。由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物（0.2μl分子量内标×进样数+9.8μl去离子甲酰胺×进样数），将10μl上样混合物与1μl扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡，95℃变性5min，冰浴后电泳，用ABI3130遗传分析仪检测分析。

2 结果

2.1阳性模板的制备 本研究根据7个基因SNP位点，应用定点突变技术在野生型的基础上得到相应的DNA阳性模板，各个基因的SNP多态性如表2所示。

表2 心源性猝死相关基因SNP多态基因型

基因名称

基因型 KCNE1 KCNH2 SCN5A KCNJ11 CACNA1C CACNB2BNUP155

野生型 AACC CC GG GG CC GG

突变型 A/G GGC/T C/T TT A/G A/G C/T A/G

2.2 AS-PCR 反应条件优化 运用AS-PCR方法同时检测这7个SNP多态位点。为了实现运动性猝死基因检测的高效性，特异性，要求各个PCR扩增反应的Tm值（退火温度）基本一致，而由于半巢式PCR方法扩增目的基因，存在PCR引物竞争，选择最优的退火温度和引物浓度的电泳，如图3所示。检测的7个基因中，KCNE1基因的参考片段大小为894bp，目的条带大小为754bp；KCNH2基因的参考片段大小为760bp，目的条带大小为579bp；KCNJ11基因的参考片段大小为795bp，目的条带大小为624bp；SCN5A基因的参考片段大小为764bp，目的条带大小为698bp；CACNA1C基因的参考片段大小为851bp，目的条带大小为203bp；CACNB2B基因的参考片段大小为914bp，目的条带大小为750bp；NUP155基因的参考片段大小为610bp，目的条带大小为321bp。

图3

2.3检测样本的基因分型及测序验证 检测50个猝死个体的血液样本，结果如表3，其中9号、22号，27号，40号样本检出阳性结果，将阳性样本的PCR产物回收，经ABI3130测序仪测序，琼脂糖凝胶得到的基因分型结果与测序结果完全一致。电泳图和测序，如图4所示。9号样本运动性猝死基因分型电泳图中，1号泳道和2号泳道700bp位置左右出现目的扩曾条带，大小与理目的条带理论值698bp吻合，检为A/G杂合，与测序结果一致，表明该个体存在潜在的猝死风险；27号样本运动性猝死基因分型电泳图中，4号泳道700bp位置左右出现目的扩曾条带，大小与理目的条带理论值698bp吻合，3号泳道无目的条带出现，检为GG纯合，与测序结果一致，表明该个体存在较高的猝死风险；22号样本运动性猝死基因分型电泳图中，5号泳道和6号泳道700bp位置下方出现目的扩曾条带，大小与理目的条带理论值579bp吻合，检为C/T杂合，与测序结果一致，表明该个体存在潜在的猝死风险；40号样本运动性猝死基因分型电泳图中，7号泳道和8号泳道300bp位置左右出现目的扩曾条带，大小与理目的条带理论值321bp吻合，检为A/G杂合，与测序结果一致，表明该个体存在潜在的猝死风险。

图4

3 讨论

本研究检测的50个猝死样本中，发现KCNE1基因的两种突变型各1例，KCNH2基因突变1例。临床研究结果显示，中国汉族人群中广泛存在KCNE1、KCNH2、KCNJ11单核苷酸多态性改变，从而导致室性心动过速的猝死。因此，钾离子通道相关基因导致的猝死属于高危基因突变型；未发现钠离子通道相关基因SCN5A，钙离子通道相关基因CACNA1C、CACNB2B的突变，这两类基因突变导致的运动性猝死在人群中分别约占1～5‰和0.1～0.3‰，属于低度危险突变型；发现NUP155基因的突变1例，据文献报道[11]，编码核孔复合物组分的基因NUP155基因是中国汉族人群中发现的与运动性猝死显著相关的特有基因。50例猝死样本中，检出4例与本研究靶基因相关的阳性突变。可能的原因是，在猝死的样本中，除了有心源性猝死外，还有脑源性猝死，或者其他原因的导致的猝死。而且在猝死的案例中，因基因突变导致心功能受损而发生猝死的比例也较其它原因猝死概率低。从猝死样本检测出4例基因突变阳性样本，表明本研究所采用的方法可靠，结果准确，但是，与钠离子、钙离子通道相关的3个基因型没有检测到临床阳性样本，因此还须通过筛查大量的临床猝死样本来确保检验方法的可靠性。

引物设计、PCR反应条件是决定AS-PCR特异性和敏感性的重要环节。本研究在AS引物的倒数第2位引入错配碱基大大提高了检测特异性，而在设计引物和实验中进行一系列优化最终将7个基因的退火温度统一则大大提高了检测的效率。但是，AS-PCR方法也存在一定的局限性，比如：当基因数目较多，由于引物数量和PCR扩增的数量增多，同时需要优化大量的实验条件，而且很难将所有基因的退火温度统一起来；当同一个基因的位点较多时也存在这种情况。此外，由于不同引物的反应条件不同，混合在一起引物竞争的情况比较复杂，不能将所有的检测位点于1管PCR反应中完成，检测通量受到限制。因此。AS-PCR方法在检测通量方面仍然有很大的提升空间，希望在后续的研究中能够结合多重PCR等技术来扩展其检测通量和应用范围。

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