利用异源酵母功能互补法研究水稻铵转运体OsAMT1；1功能及调控机制

计划（编号：91125028）。

作者简介：杨顺瑛（1982—），女，湖北恩施人，博士，主要从事分子植物营养学研究。Tel：（025）86881553；E-mail：ysy@issas.ac.cn。

通信作者：苏彦华，山东济宁人，博士，教授、研究员，从事植物营养与分子生物学研究。E-mail：yhsu@issas.ac.cn。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，生长在淹水条件下，以铵为主要氮源[1]。铵转运体（ammonium transporter，AMT）家族基因编码的铵转运系统，是水稻铵吸收和代谢的重要途径[1-2]。水稻中至少存在12个铵转运体基因，分为两大家族，OsAMT1；1-1；3归属于AMT1家族，其余9个基因包括OsAMT2；1-2；3、OsAMT3；1-3；3、OsAMT4、OsAMT5；1-5；2归属于AMT2家族[3]，其中，有关水稻铵转运体1；1（Oryza sativa ammonium transporter1；1，OsAMT1；1）基因的表达规律及超表达转基因水稻的研究取得一定进展。 OsAMT1；1在根部和地上部更倾向于组成型表达，可能负责根部从外界吸收铵[2]；过表达研究表明，OsAMT1；1能够增强铵的吸收和体内的铵含量[4]；和野生型相比，在铵次优和最优条件下，OsAMT1；1表达水平高于野生型20多倍，铵吸收速率明显高于野生型，同时，体内高铵含量也促进氮同化途径基因的表达，使体内氮同化产物、叶绿素、淀粉、糖类及产量都有较大提高，暗示OsAMT1；1有提高氮利用效率、植物生长及粮食产量的潜力[1]。然而，对OsAMT1；1铵转运蛋白调控机制的研究进展不大。 本试验采用酵母功能互补方法，初步研究不同外界pH值、铵的同系物甲基铵（methylammonium，MeA+）、羰基氰化间氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP）及离子钙（Ca2+）的螯合剂乙二醇二乙醚二胺四乙酸[ethyleneglycol-bis（beta-aminoethylether）-N，N′-tetraacetic acid，EGTA]等处理条件对OsAMT1；1的调控机制，以期为进一步解析OsAMT1；1在水稻铵代谢中的功能提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

试验用大肠杆菌菌株为Escherichia coli DH5α，中国科学院南京土壤研究所实验室保存；所用表达宿主菌株为酿酒酵母铵转运体缺失突变体31019b（mep1Δ，mep2Δ：：LEU2，mep3Δ：：KanMX2 ura3），由德国Hohenheim大学Nico Von Wirén教授惠赠，在外界铵作为唯一氮源且浓度低于5 mmol/L时，此菌株不能正常生长[5]；酵母表达载体pYES2，购于 Invitrogen 公司；YNB培养基，不含硫酸铵和氨基酸（yeast nitrogen base w/o ammonium sulfate and amino acids），购于Difco公司；D-半乳糖、精氨酸、氯化铵和甲基胺（methylammonium，MeA+），购于Sigma公司；PCR扩增高保真酶PrimeSTAR，购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶KpnⅠ和NotⅠ，购于New England Biolabs公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2酵母表达载体OsAMT1；1-pYES2的构建

参照文献[3]中OsAMT1；1 ID号，从水稻基因组数据库TIGR （http：//rice.plantbiology.msu.edu/）检索OsAMT1；1的cDNA序列，大小为1 497 bp。设计引物OsAMT1；1-KpnⅠ-P1：5′-GTCGGTACCATGGCGACGTGCGCGGCGGACCTG-3′和OsAMT1；1-NotⅠ-P2：5′-GTCGCGGCCGCTTACACTTGGTTGTTGCTGTTGG-3′，以粳稻日本晴（Oryza sativa. ssp. Japonic Nipponbare） cDNA为模板，扩增OsAMT1；1基因。扩增条件为：95 ℃预处理5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物用MN （MACHEREY-NAGEL）胶回收试剂回收，利用常规rTaq酶在无引物PCR反应体系中72 ℃反应20 min，将产物的3′端加上碱基A，然后连接到pMD18-T vector，转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆送北京六合华大基因科技有限公司上海分公司测序。用限制性核酸内切酶KpnⅠ和NotⅠ，分别酶切测序正确的阳性克隆和酵母表达载体pYES2，回收并用T4 DNA连接酶连接目的片段和载体大片段，转化DH5α，筛选鉴定并获得OsAMT1；1-pYES2 阳性克隆。

1.3酵母培养和转化

采用电转化仪Micro Pulser（Bio-Rad公司），将OsAMT1；1-pYES2和空载体pYES2分别转入酵母铵转运体缺失突变菌株31019b感受态细胞，电击后加入1 mL预冷的 1 mol/L 山梨醇，30 ℃度温育2 h，于酵母选择性培养基（017% YNB+2 mmol/L精氨酸+2% D-半乳糖+2%琼脂）平板上30 ℃黑暗培养3 d；挑取单菌落在酵母液体选择培养基中30 ℃振荡培养36 h，经PCR鉴定为阳性的单菌落即为重组酵母OsAMT1；1-pYES2/31019 b。重組酵母菌株在YNB液体选择性培养基上培养至D600 nm为1.0，经10倍梯度稀释成10-1、10-2、10-3 3个浓度，分别取4个浓度梯度的菌液5 μL，点样于以2 mmol/L精氨酸，或pH 值为5.8、不同浓度NH4Cl为唯一氮源，或2 mmol/L NH4Cl 为唯一氮源，pH值分别为4.8、5.8、6.8和不同处理试剂（EGTA，MeA+或CCCP）的固体培养基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+2%琼脂）上，于30 ℃黑暗培养，观察菌落生长状况并适时拍照。 所有处理均以转空载体pYES2的31019b酵母pYES2/31019b为对照。

2结果与分析

2.1OsAMT1；1-pYES2载体构建

以水稻Nipponbare cDNA为模板，以OsAMT1；1-KpnⅠ-P1 和OsAMT1；1-NotⅠ-P2为引物，进行PCR扩增，获得长度为1 497 bp的产物（图1-a）；纯化并连接pMD18-T载体，经转化、筛选和测序获得阳性克隆OsAMT1；1-pMD18-T；用KpnⅠ和NotⅠ分别酶切质粒OsAMT1；1-pMD18-T和pYES2，胶回收获得线性目的片段OsAMT1；1和pYES2载体大片段，用T4 DNA 连接酶连接目的片段和载体大片段，16 h 后经转化筛选鉴定，获得阳性质粒OsAMT1；1-pYES2，其酶切验证图谱见图1-b，OsAMT1；1-pYES2质粒构成见图 1-c。将获得的阳性质粒电转化至31019b酵母感受态细胞，获得阳性重组菌株用于本研究。

2.2OsAMT1；1的酵母功能互补结果

试验结果表明，在以2 mmol/L 精氨酸为唯一氮源的固体培养基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+2 mmol/L精氨酸+2%琼脂）上，转化了OsAMT1；1-pYES2和空载体pYES2的菌株都能正常生长（图2-a）；在以0.02、0.2、2 mmol/L NH4Cl为唯一氮源的培养基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+不同浓度的铵+2%琼脂）上，转化空载体的酵母pYES2/31019b不能正常生长，而转化了OsAMT1；1-pYES2的重组酵母能够正常生长（图2-b），并随铵浓度不断升高，重组酵母OsAMT1；1-pYES2/31019b生长得越好。这说明OsAMT1；1具有吸收铵的功能，能够介导铵的吸收。

2.3甲基铵对OsAMT1；1吸收铵功能的影响

甲基铵是铵的有机同系物，通常作为铵的竞争吸收底物而用于研究铵转运体的功能[6-7]。由图3可见，在017%

YNB、2% D-半乳糖和25 mmol/L MeA+固体培养基上培养48 h或96 h，转化了OsAMT1；1的酵母菌株能够生长，而照菌株生长极其微弱，甚至观察不到生长迹象，这表明OsAMT1；1能够吸收甲基铵，并以其为氮源促进31019b的生长；在017% YNB、2% D-半乳糖和100 mmol/L MeA+固体培养基条件下，转化了OsAMT1；1的酵母菌株可能吸收过多的甲基铵而致死；在铵和甲基铵共存时（0.17% YNB、2% D-半乳糖和2 mmol/L NH+4添加25 mmol/L或100 mmol/L MeA+），转化了OsAMT1；1的酵母菌株生长恢复正常，这些均表明OsAMT1；1也能够介导吸收甲基铵，在铵和甲基铵共存时，OsAMT1；1会优先吸收铵，对铵具有较高选择性。

2.4外界pH 值对OsAMT1；1功能的影响

在2 mmol/L NH+4作为唯一氮源、pH值分别为4.8、5.8、6.8）的固体培养基（0.17% YNB+2% D-半乳糖+2 mmol/L铵+2%琼脂）上，转化空载体的酵母pYES2/31019b不能正常生长，重组酵母OsAMT1；1-pYES2/31019b生长良好（图4）。这说明OsAMT1；1转运铵的能力可能与外界质子无关，对铵的吸收可能不受外界质子的调控，并且OsAMT1；1转运体蛋白转运铵的底物是离子态铵。

2.5CCCP对OsAMT1；1功能的影响

羰基氰化间氯苯腙（CCCP）是一种解偶联剂[8]，最早用于研究线粒体和叶绿体的氧化磷酸化解偶联过程[9]。在含0.17% YNB、2% D-半乳糖和2 mmol/L NH4Cl固体培养基中添加100 μmol/L CCCP时，转化了OsAMT1；1的酵母和对照菌株几乎都观察不到生长迹象（图5），CCCP强烈抑制OsAMT1；1对铵的吸收，OsAMT1；1的吸铵过程可能是一个依赖能量的主动运输过程。

2.6EGTA对OsAMT1；1功能的影响

乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）是一种钙离子螯合剂，在含0.17% YNB、2% D-半乳糖和2 mmol/L NH4Cl固体培养基中添加 1 mmol/L EGTA 时培养48、96 h， 重组酵母OsAMT1；1-pYES2/31019b能够正常生长，和未添加EGTA的YNB 培养基上几乎没有差别（图6）， OsAMT1；1对铵的吸收可能不受Ca2+参与的磷酸化过程调控。

3结论与讨论

植物从土壤环境中吸收铵主要由高亲和与低亲和的转运系统介导，在铵浓度大于1 mmol/L时，一般认为，主要通过离子通道调控铵的内流[10-12]；当外界铵浓度小于1 mmol/L时，主要是通过高亲和铵转运系统介导铵的吸收[13-14]。在通气良好的农业土壤中，硝酸盐是主要的无机氮形式，植物吸收的硝酸大于铵，相反，在通气不良的农业土壤尤其是水田，铵是主要的无机氮形式。 水稻是一种喜铵和耐铵的作物[15-16]，在整个生育期几乎全部以铵态氮为营养[2]。OsAMT1；1能够介导铵的吸收，是一个功能型的铵转运体，在外界铵为唯一氮源的条件下，能够互补铵转运体缺失突变体酵母菌株31019b的生长[2]，并随外界铵浓度的升高，重组菌株OsAMT1；1-pYES2/31019b 的生长越好。在外界铵浓度变化的情况下，OsAMT1；1对铵的吸收起着非常重要的作用。

长期以来，植物AMT吸收转运铵是以分子态NH3还是离子态铵一直是研究者们关注的焦点。在外界不同pH 值条件下，重组菌株OsAMT1；1-pYES2/31019b的生长状况几乎没有差别，OsAMT1；1转运体蛋白对铵的吸收不受外界质子的调控，转运的底物是铵离子而非分子态NH3，和PcAMT1-1类似[17]，可能都是不受外界质子调控的铵转运体。电生理手段证明，当外界pH从酸性值变化为碱性时，铵转运体介导的电流大小和方向几乎没有改变，这与拟南芥AtAMT1；1、番茄LeAMT1；1转运铵不依赖于外界质子的转运机制结论[13，18]吻合。对于OsAMT1；1的详尽转运机制，需要进一步用电生理手段完善。

高亲和的转运系统介导铵的内流通常依赖于代谢能量，解偶联剂CCCP能够使高亲和转运系统介导铵的内流下降81%～87%[19]。在銨作为唯一氮源的YNB选择性培养基中添加100 μmol/L CCCP，几乎观察不到重组菌OsAMT1；1-pYES2/31019b的生长，OsAMT1；1对铵的吸收转运是一个依赖能量的主动运输过程。

钙是植物生长发育的一种重要信号转导分子，植物体内CBL（Calcineurin B-like Protein）被钙离子活化后，能激活 CIPK（CBL-Interacting Protein Kinase）基因蛋白来影响植物的生长发育及响应逆境胁迫信号[20-21]。拟南芥钾转运体AKT1的转运活性受CIPK23磷酸化调控，CIPK23受上游CBL1和CBL9激活，从而增强植物在外界低钾条件下对钾素的吸收[20]。本研究初步探索钙对OsAMT1；1的调控特征，OsAMT1；1-pYES2/31019b在施加钙的螯合剂EGTA 1 mmol/L 的固体培养基上生长48、96 h，与未加EGTA的生长几乎没有差别，OsAMT1；1对铵的吸收转运可能不受钙信号参与的磷酸化过程调控，其调控机制尚需进一步深入研究。

甲基铵是铵的有机同系物，通常作为铵的吸收底物或竞争吸收底物研究铵转运体的功能特征[6-7，13]，人红血细胞中的铵转运体同族体RHCG能够介导甲基铵的电中性转运，对甲基铵的吸收速率随外界pH值增加而增加[7]。本研究中，当以 25 mmol/L 甲基铵为唯一氮源时，重组菌OsAMT1；1-pYES2/31019b能够生长，而对照菌株pYES2/31019b不能生长，这表明OsAMT1；1能够介导甲基铵的吸收；当外界甲基铵浓度为100 mmol/L时，重组菌OsAMT1；1-pYES2/31019b几乎没有生长，可能是吸收甲基铵过量而致死。当在25 mmol/L或 100 mmol/L 甲基铵条件下补充2 mmol/L NH+4时，重组菌OsAMT1；1-pYES2/31019b的生长恢复正常，表明在铵和甲基铵共存的条件下，OsAMT1；1会优先、更多地吸收转运铵，对铵具有较高的选择性，这也表明OsAMT1；1在对水稻铵营养吸收方面具有至关重要的作用。

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