白藜芦醇对L6细胞的葡萄糖转运功能及生长周期信号蛋白的调控

【摘 要】目的：研究白藜芦醇（resveratrol， RSV）对于肌肉细胞葡萄糖营养摄取和生长的细胞信号过程作用，以探讨其对抗肌肉萎缩的潜在细胞机理。方法：采用分化成熟的L6骨骼肌细胞给予RSV预处理（18h），然后进行胰岛素短时刺激葡萄糖摄取及蛋白印迹实验（Western Blot， WB）。结果：RSV 预处理可明显增强胰岛素刺激的L6细胞葡萄糖摄取，而特异的SIRT1去乙酰化酶抑制剂sirtinol并不影响细胞的葡萄糖摄取功能；相应地，RSV增加细胞的葡萄糖转运蛋白-4（glucose transporter-4，GLUT-4）蛋白含量，但对胰岛素刺激的蛋白激酶B（protein kinase B， PKB）磷酸化并无影响；此外，RSV降低阻抑细胞周期循环的p21调控蛋白含量而对凋亡蛋白Bax的含量无影响，而给予尼克酰胺（NAM）则可反转RSV对p21的抑制作用。结论：RSV可通过增加L6细胞GLUT4蛋白含量促进细胞的葡萄糖营养摄取，但这一功能并不依赖于其经典的调控靶标SIRT1；另一方面，RSV可通过SIRT1减少阻抑p21的蛋白表达。因此，RSV可促进重要的营养物葡萄糖摄取，并影响细胞增殖循环过程起到对肌肉的促生长和增生作用。

【关键词】 白藜芦醇；葡萄糖摄取；GLUT-4；细胞周期；肌肉细胞

【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）12-0021-02

白藜芦醇（RSV）等天然植物化学物不仅延缓衰老，对肌肉萎缩也有治疗作用[1， 2]。此外，RSV对其它现代流行疾病，如胰岛素抵抗引发的一系列心脑血管疾病，包括中风和老年痴呆也具有明确防治作用[3， 4]。RSV抗衰老机制研究起初鉴定到的作用靶标是SIRT1，后者被认为是介导热卡限制对抗衰老的关键信号蛋白[4]。随后的研究发现，RSV对SIRT1的激活需要AMPK介导。最近一项的研究发现，cAMP是介导RSV对AMPK调控的主要信号分子[4]。此外，Nrf2和雌激素受体等抗应激和细胞保护系统也参与RVS的药效作用[5， 6]。因此，RSV很可能是通过多靶点的信号机制联合起到抗衰老和防病作用。

RSV防治衰老过程和肌肉废用所导致的功能障碍与其对抗肌肉萎缩的药理作用有密切关系，但具体作用机理仍需进一步研究阐明。为了探讨RSV防治肌肉萎缩的细胞分子机理，本工作在培养的大鼠肌肉细胞给予RSV预处理，然后对葡萄糖摄取功能及相关信号调控进行了详细研究，并对细胞循环调控蛋白及凋亡信号用WB方法进行了初步探讨

1 材料与方法

1.1材料与试剂 大鼠骨骼肌L6细胞购自ATCC公司。α-MEM细胞培养基购自Gibco公司。[3H]-2-脱氧葡萄糖（Amersham）。RSV，尼克酰胺（nicotinimide， NM）购自Sigma公司，GLUT4和GLUT1抗体（Abcam及Calbiochem公司）、p21、p27、PKB、PKBSer473、P70S6K、p-P70S6K，p38、p-p38、JNK、p-JNK及Bax抗体（Cell Signaling），辣根过氧化物酶二抗（美国Santa Cruz公司）。Sirtinol购自Calbiochem公司。BCA蛋白浓度测定盒购自上海碧云天生物技术有限公司。胰岛素购于诺和诺德公司。

1.2 L6细胞培养和处理 L6大鼠成骨骼肌细胞以含10%胎牛血清的α-MEM培养基加1%青链霉素，在37℃及5%CO2的培养箱内进行培养。细胞分化参照已报道的方法[7]。细胞分化后在无血清培养下，给予100 μmol/L RSV处理18h。

1.3 葡萄糖摄取 实验按照报道的方法进行[8]。样品放射性采用beta 液闪计数器计数，并以样品蛋白浓度进行校正。以空白对照孔的葡萄糖摄取放射性数值为1计算计算。

1.4 蛋白印迹（WB） WB方法按作者报道的方法进行[9]。

1.5 统计学分析 图中数据以均数±SE表示，组间差异以方差分析进行，*代表P<0.05。

2 结果

2.1 RSV增强胰岛素介导的葡萄糖摄取 细胞进行100 mM的RSV预处理后，基础葡萄糖摄取未收到明显影响，而在短期胰岛素刺激情况下，RSV预处理明显增强葡萄糖摄取（约升高50%，对照组与RSV预处理的胰岛素组两组相比，p<0.05，n=3，图一A）。而给予特异地SIRT1活性抑制剂sirtinol处理1h，然后进行葡萄糖摄取实验。如图2B所示，抑制SIRT1功能对葡萄糖摄取没有影响。

2.2 RSV对胰岛素信号及葡萄糖转运蛋白作用 胰岛素通过活化PKB（磷酸化）起到促进GLUT4膜转位和葡萄糖摄取作用，我们进一步利用WB方法分别研究了PKB的激活和葡萄糖转运蛋白水平。结果显示，短时胰岛素处理明显增强PKBSer473及下游蛋白p70S6KThr389的磷酸化，而RSV并不加强胰岛素的这些作用（图2）。此外，sirtinol处理也对PKB的活化没有影响。而对参与L6细胞葡萄糖转运的两种蛋白，即GLUT4和GLUT1的蛋白含量的检测表明， RSV能明显增加细胞GLUT4蛋白含量（图2），而对GLUT1蛋白含量则无这一作用（资料未显示）。

2.3 RSV对细胞增生作用 RSV可活跃参与细胞凋亡及周期循环的调控[10]，而p21和p27是细胞增殖周期循环的重要抑制性因素[11]。检查RSV对细胞循环的作用发现，RSV减少这两种蛋白的表达，而用NAM抑制SIRT1则可解除RSV的抑制作用。

2.4 RSV对细胞凋亡作用 如图4A所示，RSV并不影响应激凋亡信号蛋白JNK和p38的磷酸化水平， 亦不改变Bax凋亡蛋白水平（图4B）。

3 讨论

RSV改善肌肉功能，同时还可增加肌肉密度，II型肌纤维和线粒体数量[12]。RSV的上述作用与激活SIRT1、AMPK、Nrf2以及PGC-1α等重要的防御应激反应的调控蛋白有关[2， 12]。

肌肉萎缩是由蛋白合成和分解的平衡所决定。蛋白合成为高耗能过程，而葡萄糖是肌肉的主要供能物质。无论动物还是细胞实验，RSV干预处理可明显增强肌肉细胞的葡萄糖摄取[2]。本文研究发现，RSV的这一作用与其胰岛素增敏和上调细胞GLUT4蛋白含量有关，但RSV对基础葡萄糖摄取并无影响。这些结果与我们观察到的GLUT4水平增加，而GLUT1（基础葡萄糖摄取蛋白）无变化的实验结果相吻合。RSV有可能通过激活AMPK进而促进GLUT4蛋白表达和肌肉细胞的营养摄取。重要的是，细胞增生和凋亡决定肌肉是否萎缩。由于p21和p27是抑制细胞增殖周期的重要蛋白，我们对此进行了初步研究，发现RSV处理细胞p21和p27水平下调，而抑制SIRT1功能则反转这一作用。因此在肌肉细胞RSV可通过激活SIRT1促进细胞增殖循环，并有理由推测，RSV的这些作用应与促进骨骼肌生长和对抗肌肉萎缩作用密切关联，而与细胞凋亡过程关系不大。

因此本文研究结果，从RSV通过增加GLUT4含量增敏胰岛素促葡萄糖摄取和下调增殖周期抑制性蛋白两方面，对于了解RSV对抗肌肉萎缩的分子机理和进一步临床应用提供了新的机制解说。

参考文献：

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[7] Watt MJ， Dzamko N， Thomas WG， Rose-John S， Ernst M， Carling D， Kemp BE， Febbraio MA， Steinberg GR. CNTF reverses obesity-induced insulin resistance by activating skeletal muscle AMPK. Nat Med. 2006； 12：541-548.

[8] Breen DM， Sanli T， Giacca A， Tsiani E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 2008； 374：117-122.

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[10] Holme AL， Pervaiz S. Resveratrol in cell fate decisions. J Bioenerg Biomembr. 2007； 39：59-63.

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[12] Guerrero RF， Garcia-Parrilla MC， Puertas B， Cantos-Villar E. Wine， resveratrol and health： a review. Nat Prod Commun. 2009； 4：635-658.

作者简介：

施海滨，男，1981年生，福建中医药大学在读硕士研究生，从事天然化学物及中药对于神经肌肉疾病防治作用研究。

周子瑜， 女，1990年生，福建中医药大学在读硕士研究生，从事天然化学物及中药对于代谢性疾病防治作用研究。

于志文，男，1961年生，现为中山大学公共卫生学院营养系副教授，硕士导师。兼任福建中医药大学教授，从事天然化学物及中药对于代谢性疾病防治作用研究。

通讯作者：

于志文（1961-），男，教授，博士，研究方向：天然化学物对慢病防治作用及机理研究。E-mail：yuzhiwen@yahoo.com

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