牙龈卟啉单胞菌感染对大鼠血管平滑肌细胞细胞间黏附分子—1表达的影响

[摘要] 目的 观察牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277感染对大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法 建立体外牙龈卟啉单胞菌感染大鼠VSMC模型，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测ICAM-1基因的表达。结果 牙龈卟啉单胞菌感染VSMC 8、16、24 h后，ICAM-1表达明显增多，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。感染16 h达高峰，感染8 h与感染16、24 h比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 牙龈卟啉单胞菌感染可引起VSMC ICAM-1高表达，这提示牙周致病菌可能参与血管壁的炎症反应，在动脉粥样硬化的发生、发展中有重要的意义。

[关键词] 牙龈卟啉单胞菌； 血管平滑肌细胞； 动脉粥样硬化； 细胞间黏附分子-1

[中图分类号] Q 786 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.02.002

[Abstract] Objective To observe the effects of Porphyromonas gingivalis （P. gingivalis） ATCC 33277 infection on ex-

pression of intercellular adhesion molecule-1 （ICAM-1） in rat vascular smooth muscle cells（VSMC）. Methods An infection model of rat VSMC invaded by P. gingivalis was established in vitro. The mRNA of ICAM-1 was measured through reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results Compared with the control group， an apparent and statistically significant increase in expression of ICAM-1 mRNA was observed after 8， 16， and 24 h in P. gingivals-infected rat VSMC （P<0.05）. The expression reached its peak at 16 h. Statistically significant differences were observed in the 8 h group and in the other two experimental groups （P<0.05）. Conclusion Infection of P. gingivals in rat VSMC can cause increased expres-sion of ICAM-1， which may have an important function in the progression of atherosclerosis.

[Key words] Porphyromonas gingivalis； vascular smooth muscle cells； atherosclerosis； intercellular adhesion molecule-1

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）是血管壁的重要组成部分，在血管的功能中起着重要的作用。VSMC不仅能够通过改变血管的直径暂时缓解血液的压力，而且能够通过结构的改变来适应血压。有学者[1]研究发现，VSMC的迁移与凋亡在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）斑块的形成及破裂过程中扮演着重要的角色。

近年来，牙周病与心血管疾病的相关性研究已成为热点，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingi-valis，P. gingivalis）是牙周炎重要的致病菌之一。有研究[2]发现，在牙周炎患者中，牙龈卟啉单胞菌可以通过咀嚼、刷牙等途径进入血液循环，并且人动脉粥样斑块组织中可以检测到牙龈卟啉单胞菌的存在。目前牙龈卟啉单胞菌影响AS发生、发展的机制尚未完全阐明，尤其对血管平滑肌的影响尚未见报道。本研究观察牙龈卟啉单胞菌感染VSMC后对其细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表达的影响，多层面探讨牙龈卟啉单胞菌在AS疾病发生、发展中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物中心提供的雄性SD大鼠为研究对象，体重100 g。

1.2 试剂和仪器

P. gingivalis ATCC 33277菌株（上海交通大学医学院附属第九人民医院），RPMI-1640培养液、DMEM、胎牛血清、二甲基亚砜（dimethyl sulfo-xide，DMSO）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），青霉素（石家庄华北制药集团有限责任公司），链霉素（大连美罗药业股份有限公司），脑心浸液（brain heart infusion，BHI）培养基、L-半胱氨酸盐酸盐、氯化血红素、维生素K1、无菌脱纤维羊血（北京陆桥技术有限责任公司），细胞培养箱、超净工作台（NUAIR公司，美国），细菌培养箱（上海叶拓公司），低温高速离心机（Beckman公司，美国），倒置显微镜（Olympus公司，日本），H-300

透射电镜（transmission electron microscope，TEM）（Hitachi公司，日本），电子天平（Sartorius公司，德国）。

1.3 细胞培养

1.3.1 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的原代培养 10%水合氯醛（每100 g体重3 mL）腹腔麻醉SD大鼠后，于无菌条件下，开胸，揭起左侧肺叶，紧靠脊柱的左前方取胸主动脉，长约15 mm，冲洗去除残留的血液，剔除血管外膜，将血管剪开，用刀片轻刮去除血管内膜。将组织剪成0.5～1 mm3的小块，接种于25 cm2培养瓶中，于37 ℃恒温培养箱内（5%CO2，37 ℃，饱和湿度条件）放置3～4 h，使组织块较牢固地黏附于培养瓶壁，加入0.5～1 mL含20%胎牛血清的DMEM培养液，3～5 d更换培养液1次。

1.3.2 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的传代培养 当单层细胞长满培养瓶底的80%时可进行传代，弃去原培养液，加入0.25%胰蛋白酶约1 mL，显微镜下观察。当细胞收缩呈圆形时，立即加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。用吸管反复吹打瓶壁使细胞自瓶壁上脱落，1∶2分装成两瓶。

1.3.3 细胞鉴定以及超微观察 取对数生长期的单层细胞，弃去原培养液，加入0.25%胰蛋白酶消化，

1 000 r·min-1离心10 min，PBS清洗3次后，弃上清液，加入2%戊二醛固定2 h，1%锇酸固定2 h，丙酮序列脱水，包埋，制备半薄切片（厚度约为0.8 μm），制备超薄切片（厚度约为90 nm），醋酸双氧铀、枸橼酸铅双重染色，TEM观察细胞的形态以确定提取培养的细胞为平滑肌细胞。

1.4 细菌培养

将P. gingivalis ATCC 33277菌株接种于BHI培养基上，按比例加入氯化血红素、维生素K1、L-半胱氨酸盐酸盐、无菌脱纤维羊血，37 ℃厌氧培养（10%CO2，10%H2，80%N2）约5 d，悬菌于PBS中，配置菌液至1×1010（660 nm处光密度值达1.0，绘制生长曲线），生化革兰染色形态检查为纯培养物。

1.5 牙龈卟啉单胞菌感染VSMC模型的建立

取对数生长期的单层细胞，弃去原培养液，加入无血清的DMEM维持液，接种P. gingivalis ATCC 33277，使细菌与细胞的感染倍数为100︰1。实验设牙龈卟啉单胞菌感染VSMC 8 h组、16 h组、24 h组，另设空白对照组（细胞中仅加入无血清的DMEM维持液）。实验组内、组间各重复3次。

1.6 逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-po-lymerase chain reaction，RT-PCR）检测ICAM-1mRNA的表达提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。ICAM-1-F为：5’-AGGTATCCATCCATCCCACA-3’，ICAM-1-R为：5’-GCCACAGTTCTCAAAGCACAG-3’，扩增片段长度为240 bp。18s管家基因用作内参，18s-F：5’-GTGGAGCGATTTGTCTGGTT-3’， 18s-R：5’-CGCTGAGCCAGTTCAGTGTA-3’， 扩增片段长度为260 bp。PCR反应体系为25 μL，PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，进行30个循环，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃ 1 min，最后72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳成像，使用凝胶定量软件quantity one分析电泳条带，计算目的条带的相对浓度。

1.7 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行分析，采用方差分析进行组间比较，并进行两两比较，P<

0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VSMC形态学观察

光镜下，贴壁的VSMC多为长梭形或梭形，细胞呈“铺路石”样生长。TEM观察可见，细胞胞浆内富含肌丝，基膜下和胞浆内可见密斑和密体，在近胞膜处可见较多饮泡。牙龈卟啉单胞菌感染VSMC后，TEM观察可见：感染8 h时，仅见牙龈卟啉单胞菌黏附于VSMC表面；感染16、24 h时，牙龈卟啉单胞菌不仅黏附于VSMC表面，而且有部分牙龈卟啉单胞菌侵入VSMC的细胞质中。VSMC细胞膜不连续，肌丝减少，粗面内质网扩张，线粒体嵴呈溶合状态，高尔基体呈扁平囊样肿胀，吞噬体增多，脂滴增多（图1）。

2.2 ICAM-1 mRNA的表达结果

RT-PCR法检测ICAM-1 mRNA表达的变化，结果显示空白对照组未见ICAM-1的表达，牙龈卟啉单胞菌感染8、16、24 h后均可见ICAM-1 mRNA的表达，与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）（图2）。牙龈卟啉单胞菌感染16、24 h后，ICAM-1 mRNA表达的量几乎相同，差异无统计学意义。感染16、24 h与8 h相比，ICAM-1 mRNA表达的量增加，差异有统计学意义（P<0.05）（图2）。

3 讨论

牙周炎是一种以菌斑微生物为始动因子的慢性炎症，在牙周微生物中，革兰阴性厌氧短杆菌——牙龈卟啉单胞菌是重要的牙周可疑致病菌。牙龈卟啉单胞菌按黏附力强弱可分为高黏附菌株ATCC 33277和低黏附菌株W83。Nakagawa等[3]研究证明牙龈卟啉单胞菌有多种毒力因子，可通过毒力因子黏附于口腔组织和上皮细胞的表面，从而进一步侵入牙周组织及细胞并进行繁殖。Watanabe等[4]研究发现，无论对于上皮细胞还是成纤维细胞，P. gingivalis ATCC 33277菌株的黏附能力均高于W83菌株。因此，本研究选择高黏附菌株ATCC 33277作为研究对象。

AS是一种由多因素引发的疾病，流行病学调查显示，心血管疾病是全身性感染的先兆[5]。AS一直被认为是血管壁慢性脂质代谢异常和血管舒张功能受损的过程。近年来，一些学者[6]提出AS不单纯是由于脂质沉积所致，而是一种炎症性疾病，局部和远隔部位感染可以促进AS的慢性炎症过程。Inaba等[7]研究得出牙龈卟啉单胞菌与平滑肌细胞的迁移和增殖有关。目前认为，AS的形成是动脉对内膜损伤的反应，血管内膜损伤后，引起血流动力学改变，产生湍流剪切应力，从而导致低密度脂蛋白进入内膜和内膜下，使平滑肌细胞增殖并迁移至内膜，使单核细胞聚集于内膜发展成为泡沫细胞。本实验建立牙龈卟啉单胞菌感染VSMC的体外模型，研究发现：被牙龈卟啉单胞菌感染的VSMC细胞膜不连续，细胞器的形态发生变化，感染16 h时，有牙龈卟啉单胞菌侵入到VSMC的细胞质中，牙龈卟啉单胞菌仍然保持着表面的菌毛和外膜结构。这表明牙龈卟啉单胞菌的侵入有可能导致VSMC凋亡，从而引起AS斑块的形成。

ICAM-1是细胞黏附分子的免疫球蛋白超家族类，属于亲异性细胞黏附分子（cell adhesion mole-cule，CAM），配体为整合素，其在活化的血管内皮细胞中表达。ICAM-1是介导炎症细胞和血管内皮细胞黏附与迁徙的主要黏附分子之一，以配体受体相结合的形式发挥作用，导致细胞与细胞间、细胞与基质间或细胞-基质-细胞之间的黏附。O’ Malley等[8]研究发现：可溶性细胞间黏附分子-1（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）的测定可作为冠心病早期诊断的分子标志。炎症时，活化的内皮细胞表面的ICAM可与白细胞表面αLβ2及巨噬细胞表面的αMβ2相结合，从而使白细胞固着于炎症部位的脉管内皮上，并发生铺展，进而分泌水解酶而穿出脉管壁。在不同条件下，多种细胞均会表达ICAM-1，但在体外牙龈卟啉单胞菌刺激VSMC高表达ICAM-1还未见报道。本实验中ICAM-1在正常的平滑肌细胞中几乎未见表达，而牙龈卟啉单胞菌感染VSMC 8 h后，可见有ICAM-1 mRNA的表达，感染16 h达到高峰，并持续至24 h。这提示了牙龈卟啉单胞菌能通过激活VSMC ICAM-1的表达，从而参与AS的形成与发展。

有文献[9]报道，血管内皮细胞可以通过自噬现象，促进牙龈卟啉单胞菌侵入细胞中，牙龈卟啉单胞菌具有寄居宿主细胞能力，从而躲避被杀伤[10]。牙龈卟啉单胞菌感染平滑肌细胞是通过侵袭还是有细胞自噬现象参与，其具体机制还不是很清楚。本研究从另一个角度证明牙周炎主要致病菌对冠心病的发生、发展的可能促进作用，但牙周炎和冠心病的关系及机制仍需进一步的研究。

[参考文献]

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[3]Nakagawa I， Amano A， Kuboniwa M， et al. Functional dif-ferences among FimA variants of Porphyromonas gingivalis and their effects on adhesion to and invasion of human epi-thelial cells[J]. Infect Immun， 2002， 70（1）：277-285.

[4]Watanabe K， Yamaji Y， Umemoto T. Correlation between cell-adherent activity and surface structure in Porphyromo-nas gingivalis[J]. Oral Microbiol Immunol， 1992， 7（6）：357-

363.

[5]Ridker PM， Rifai N， Stampfer MJ， et al. Plasma concentra-tion of interleukin-6 and the risk of future myocardial in-farction among apparently healthy men[J]. Circulation， 2000， 101（15）：1767-1772.

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[8]O’Malley T， Ludlam CA， Riemermsa RA， et al. Early in-crease in levels of soluble inter-cellular adhesion molecule-1 （sICAM-1）； potential risk factor for the acute coronary syn-dromes[J]. Eur Heart J， 2001， 22（14）：1226-1234.

[9]Mao S， Maeno N， Matayoshi S， et al. The induction of in-tercellular adhesion molecule-1 on human umbilical vein endothelial cells by a heat-stable component of Porphyro-monas gingivalis[J]. Curr Microbiol， 2004， 48（2）：108-112.

[10]Rodrigues PH， Bélanger M， Dunn W Jr， et al. Porphyromo-nas gingivalis and the autophagic pathway： an innate immune interaction[J]. Front Biosci， 2008， 13：178-187.

（本文采编 周学东）

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