毛细管电泳定量分析兔血管平滑肌细胞内外源基因ＲＴ－ＰＣＲ产物

【摘要】 目的 应用毛细管电泳的方法定量分析体外培养的兔血管平滑肌细胞中外源基因mRNA的表达水平。方法 构建兔特异性金属蛋白酶组织抑制剂3（TIMP-3）基因重组质粒载体，通过阳离子脂质体介导转染兔平滑肌细胞；实验分为重组质粒组、空质粒载体组、正常对照组；转染48小时后抽提各组总RNA，按照RT-PCR方法进行扩增；对重组质粒载体进行双酶切，提纯TIMP-3DNA并进行浓度测定，按照已知浓度对其进行毛细管电泳，绘制TIMP-3DNA标准浓度曲线图；对RT-PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳及毛细管电泳，观察结果并依据标准浓度曲线公式计算RT-PCR产物的含量。结果 琼脂糖凝胶电泳中，重组质粒组在TIMP-3基因相应的碱基位置出现明显的阳性条带，而其他两组未见明显的条带；毛细管电泳结果显示重组质粒组TIMP-3DNA含量明显高于正常对照组及空载体质粒组，P<0.05，差别具有显著性意义。讨论 CE是一种高效的定性定量方法， RT-PCR产物可以用毛细管电泳直接分离定量。

【关键词】 毛细管电泳 定量分析 基因转染 特异性金属蛋白酶组织抑制剂-3

一 引言

1981年Jorgenson和Lukacs[1]首先提出了在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离的可能性，创立现代毛细管电泳（capillary ekctrophoresis，CE）。由于CE极大地满足了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶、抗体)、核酸乃至脱氧核糖核苷酸(DNA)甚至单细胞的分离分析要求，短短十几年间得到迅速发展。CE的优点可概括为：①高灵敏度，常用紫外检测器的检测限可达10^-13～10^-15mol，激光诱导荧光检测器则达10^-19～10^-21mol；②速度快，一般分析不会超过30 分钟，有的甚至几分钟；③样品少，只需nL（10^-9L）级的进样量；④成本低，只需少量流动相和价格低廉的毛细管；⑤模式多，几种常用的模式有：毛细管区带电泳、胶束毛细管电动色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管等速电泳、毛细管电色谱、毛细管亲和电泳以及各种各样的衍生方式。[2]毛细管电泳技术以其高的分辨率被应用到人类基因组分析的DNA高速测序、DNA多态分析、PCR分析、DNA诊断、鉴定等方面上。[3]-[7]另外利用CE还可进行Southern blot杂交研究，用Southern等提出的转移技术进行基因组DNA 的特定序列分析是分子生物学的基本技术之一。[8]本实验通过TIMP-3重组基因转染兔主动脉平滑肌细胞，应用P/ACE MDQ毛细管电泳系统检测目的基因RT-PCR产物，定量分析各组细胞TIMP-3mRNA水平。

二 实验部分

2.1 基因转染材料与方法

2.1.1 兔TIMP-3基因表达载体构建：质粒pcDNA3.1+,大小为5428bp，美国Invitrogen公司生产；兔TIMP-3 cDNA序列由NCBI nucleotide基因库提供，基因全长为454bp；克隆位点：BamHI和EcoRI；由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2.1.2 分离纯化重组质粒DNA: 分别挑取含有重组质粒E.coli DH5α菌和空载体E.coli DH5α菌至50ml含50μg/ml Amp+的LB培养液过夜培养；将过夜培养的细菌，角转5000rpm室温离心10分钟，彻底去除上清。按照上海生工公司UNIQ-200质粒抽提试剂盒说明进行质粒分离纯化。用紫外分光光度计测定其浓度。

2.1.3 细胞培养和传代：将兔主动脉平滑肌细胞悬液移入25cm²培养瓶中，置37℃温箱培养。取长成致密单层的细胞倒去培养液，加入DPBS（不含Ca²+和Mg²+的磷酸盐缓冲液），轻轻振荡漂洗细胞后倾去，加入适量0.25%胰蛋白酶溶液，37℃下消化2－3分钟后终止，吹打成单细胞悬液，用培养液调整细胞浓度为5×10^-5/ml，各取100μl接种于铺有10μl ECMgel（细胞外基质胶，购至美国SIMGA公司）的24孔板内，加入20%胎牛血清的DMEM培养液400μl。37℃，CO₂温箱中培养细胞贴壁生长到90%左右；转染前换成500μlDMEM-SF无血清培养液，不含抗生素。

2.1.4细胞转染：分别取38.4μg重组质粒DNA和38.4μg空载体质粒DNA与高糖DMEM-SF液混匀，各2.4ml；取192μl lipofectamine2000阳离子脂质体转染试剂（购至美国Invitrogen公司）加入高糖DMEM-SF液至4.8ml，室温下5分钟。将稀释的阳离子脂质体各2.4ml分别与稀释的重组和空质粒DNA混合，轻摇匀，室温下孵育20分钟。倒去细胞培养液，用DMEM-SF培养液润洗细胞一遍，将4.8ml混合物按照每孔100μl，分别加入重组质粒组和空载体组的24孔板中，轻轻混匀；正常组每孔加入100μlDMEM-SF培养液，三组在37℃ CO₂温育箱中共同孵育4h。吸去转染液，加入DPBS液，轻轻振荡漂洗细胞后弃去，加入10%胎牛血清的DMEM培养液500μl继续培养48小时。

2.2 各组总RNA提取和TIMP-3基因RT-PCR扩增

2.2.1 TIMP-3特异性引物和α-actin引物合成：TIMP-3基因引物设计：上游5"TCTGCAACTCCGACATCGTG 3"下游5"CGGATGCAGGCGTAGTGTT 3"，PCR扩增产物长度454bp；a-actin内参引物设计：上游5"CCAGAGCGCAAATACTCC 3" 下游 5"ATTCACAGTTGTGGGCTAGAA3"PCR扩增产物长度171bp。

2.2.2 总RNA提取：48小时后收集细胞，300转/分，离心5分钟，彻底去上清；按照上海生工公司ΜNIQ-10柱总RNA抽提试剂盒说明进行总RNA抽提。洗脱得到的RNA存放在-20℃备用。

2.2.3 PCR扩增:按照上海生工公司MMLV一步法RT-PCR试剂盒说明进行操作。程序设计：cDNA合成和预变性40℃30分钟，94℃2分钟；PCR扩增40个循环：94℃15秒，55℃30秒，72℃30秒；终延伸72℃10分钟。PCR体系：2×反应混合液25μl，总RNA10μl，正义引物(10μmol/L)1μl，反义引物(10μmol/L) 1μl，a-actinF(10μmol/L) 1μl，a-actinR(10μmol/L)1μl， RT/Taq混合酶1μl，无菌双蒸水10μl，总体积50μl。稍离心，确保所有组分都在管底，然后进行热循环。

2.2.4 PCR产物1.7%琼脂糖凝胶电泳：将1.7g Agarose溶于100ml 0.5×TBE buffer；加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。用水浴的办法使胶冷却到60℃左右，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。室温凝胶30分钟，拔梳子，放入电泳槽。样品中加入loading buffer使其终浓度为1×，沿着胶孔的边缘匀速加入。接通电源，选择70V电压，时间为1h。电泳完毕，用0.5μg/ml的EB溶液浸染30分钟。在254nm紫外灯下观察结果。

2.2.5 双酶切重组质粒获取并提纯TIMP-3DNA：BamHI和EcoRI限制性内切酶及缓冲溶液均购至上海生工公司。取清洁干燥并经灭菌的0.5mlEP管,用微量移液枪分别加入重组质粒DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×Tango缓冲液2μl,再加入超纯水使总体积为18μl,将管内溶液混匀后加入BamHI及EcoRI酶液各1μl,用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。混匀反应体系后,将EP管置于37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。每管加入2μl 0.1mol/L EDTA (pH8.0),混匀,以停止反应。酶切产物经琼脂糖电泳后用0.5μg/ml的EB溶液浸染30分钟。在254nm紫外灯下观察结果。将含有TIMP-3DNA条带的胶块切取下来，按照上海生工公司UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明进行提纯。用紫外分光光度计测定其浓度。

2.3 毛细管电泳材料和主要设备

Beckman P/ACE System MDQ毛细管电泳仪(美国贝克曼公司)，石英毛细管柱(50μm×50cm)；所有溶液在进入毛细管仪之前，经0.45μm微孔滤膜过滤。操作前，毛细管用超纯水和电泳缓冲液清洗20-30分钟左右。每次电泳前，先用分离缓冲溶液TBE（Tris：0.1mol/L，硼酸：0.1mol/L，EDTA：2.0mol/L，pH 8.1) 在1kPa的压力下冲洗3分钟。将羟丙基甲基纤维素（HPMC）溶于TBE缓冲液中形成1.8％HPMC无胶筛分介质。电泳缓冲液和样品在进样前去除气泡。UV检测波长254nm，柱温35℃，恒压操作模式，电牵引进样10kV·10s，分离电压为20 kV，电流为8.0A，由负极向正极电泳，电泳时间为10分钟。

三 结果

3.1 RT-PCR产物普通琼脂糖电泳结果：

各组兔平滑肌细胞总RNA经RT-PCR扩增后，通过1.7%琼脂糖凝胶电泳在254nm紫外光下可见在400-500bp之间出现目的基因TIMP-3DNA条带，在100-200bp之间出现内参照?琢-actinDNA条带（如图1所示）。重组质粒组（如图1所示）呈现强阳性TIMP-3DNA条带；而正常对照组与空载体质粒对照组未见明显TIMP-3DNA条带。

3.2 RT-PCR产物毛细管电泳：

将步骤2.2.5中得到的高纯度TIMP-3DNA，按照0.1、0.5、1.0、2.0、3.0mmol/L,已知浓度进行毛细管电泳（如图2所示），在电泳进行到4分钟左右出现特征性尖峰，即TIMP-3DNA峰，应用毛细管电泳32 Karat 软件计算峰面积，重复测量一次，取平均值，以浓度为x轴、峰面积为y轴描绘浓度－峰面积曲线图，得到TIMP-3DNA标准浓度曲线（如图3所示）。并由此得到TIMP-3DNA浓度-峰面积线性公式：y=5163.4x 。

按照成组设计方差分析，应用SPSS12.0软件包对表1数据进行统计学分析，结果如表2所示。从表2中可知正常对照组与重组质粒组之间，空载体质粒组与重组质粒组之间TIMP-3DNA浓度均数相比较 P<0.05，具有显著性差别，有统计学意义；正常对照组与空载体质粒组之间P=0.353>0.05,无统计学意义。分析结果可知重组质粒组TIMP-3DNA转录水平明显高于正常对照组和空载体质粒组。

4 讨论

正常细胞培养情况下细胞表达TIMP-3甚微。本实验将外源TIMP-3基因转染入细胞，从琼脂糖凝胶电泳图上可知细胞成功地进行mRNA合成。不足的是，我们只能知道目的基因是否转染成功，无法计算各实验组目的基因RT-PCR产物的确切含量。而CE是一种高效的分离分析方法，广泛用于定性定量分析中。学者Sill M[9] 等用毛细管电泳和激光诱导荧光法检测到细胞中某一基因NQO1表达后反转录产物的含量；Kannan Srinivasan [10]利用CE分析了线粒体DNA 中3个基因座位的多样性的PCR产物，对1000bp以下的片段，依据其长度不同，可使相差1～4个重复单位的等位基因完全分离，并能区分纯合子和杂合子。[11]毛细管无胶筛分电泳是在毛细管中添加一定浓度和组成的线性高分子溶液，高分子之间交缠成网状而起到筛分作用。一般来说，大片段的核酸分子在低浓度的介质中获得很好的分离，而小片段的核酸分子则需要高浓度的介质。但较高浓度的介质溶液具有较高的粘性，给操作带来不便。研究表明，标准DNA片段在加入6％甘露醇的低浓度羟丙基甲基纤维素（HPMC）中可以获得很好的分离。[12]-[13]本实验选择1.8％HPMC无胶筛分介质中对RT－PCR产物进行毛细管电泳，定量分析外源目的基因TIMP－3DNA的转录水平。TIMP-3是特异性金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）家族成员。TIMPs与基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）共同调节细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)降解平衡，两者形成一一对应的复合物。[14]-[16]实验通过绘制TIMP－3DNA标准曲线图得到TIMP-3DNA浓度－峰面积线性公式，并应用该公式计算出各组在相同毛细管电泳条件下TIMP-3DNA准确含量。根据计算结果重组质粒组平均TIMP-3DNA含量为1.32888±0.855457 mmol/L，正常对照组为0.05737±0.033776 mmol/L，空载体质粒组为0.08950±0.077613 mmol/L，由此可见重组质粒组目的基因PCR产物含量高出其他两组约十几倍。当然在本实验中得到是TIMP－3mRNA经反转录后PCR产物的含量，真正的转录水平需要对mRNA进行毛细管电泳。由于RNA酶普遍存在于空气、玻璃器皿等各处，灭活难度大，需要严格的实验条件，因此还有待于实验技术的进一步改进才有可能实现。随着新型检测器、新型分离材料、仪器微型化等方面的研究以及与其它方法和技术联合应用的进一步深入，相信CE在未来的分析领域中的前景会更加广阔。

参考文献

〔１〕Jorgeson J.W，Lukacs K.D．Zone electrophoresis in open-tubularglass capillaries．Anal Chem． 1981，53：1298．

〔2〕金良，甘莉．毛细管电泳在蛋白质和核酸分析研究中的应用．华中农业大学学报．2003，22(1)：73－76．

〔3〕许琪，吴冠芸．毛细管电泳与核酸分析．国外医学分子生物学分册．2000，22（2）：120-123.

〔4〕徐娟，孔科.毛细管电泳在DNA分析中的应用.生物技术.2004,14(1)：54－56.

〔5〕廖杰，赵玉兰.毛细管凝胶电泳在临床分子生物学研究中的应用.生理科学进展.1999，30（2）：159－162.

〔6〕沈霞.高效毛细管电泳的临床应用及进展.中华检验医学杂志.2004，27（12）：883－885.

〔7〕梁琼麟，罗国安，王义明.高效毛细管电泳在核酸、蛋白质分析中的新进展. 分析化学（评述与进展）.2003，31（12）：1514－1519.

〔8〕Vilenchik M ，Belenky A，Co hen A S．Monitoring and analysis of antisense DNA by high-perform ance capillary gel electrophoresis．J Chromatogr. 1994，663：l05-l13.

〔9〕Sill M，Kolesar，Jinee Deta1．Quantitative analysis of NQOl gene expression by RT－PCR and CE－LIF．J CAP ELEC. 1995，002：287－290.

〔10〕Kannan S. Electrophoretic separation of polymerase chain reaction-amlified DNA fragments in DNA typing using a capillary electrophoresis-laser induced fluorescence system. J Chromatogr A. 1993，652：83-9l.

〔11〕仇东辉，余伍忠，王铮，等. 毛细管电泳技术及其在医学中的应用. 中华实用医学. 2004，6（l8）：49－51.

〔12〕丁文静，许 旭，梁宏睎，等. 基于纤维素衍生物的毛细管无胶筛分电泳及其应用. 分析科学学报. 2004，20（2）：204－209.

〔13〕李杰萍，梁统，周克元. 毛细管电泳定量分析在大鼠腹腔巨噬细胞中5－脂氧合酶信使核糖核酸表达中的应用. 中华检验医学杂志. 2004年，2（1）：34－36.

〔14〕Yeow KM, Kishnani NS, Hutton M, et al. Sorsby"s fundus dystrophy tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP-3) mutants have unimpaired matrix metalloproteinase inhibitory activities, but affect cell adhesion to the extracellular matrix. Matrix Biol.2002，21：75-88.

〔15〕Leco KJ, Waterhouse P, Sanchez OH, et al. Spontaneous air space enlargement in the lungs of mice lacking tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP-3).J Clin Invest. 2001，108：817-829.

推荐访问： 平滑肌 毛细管 定量分析 电泳 产物

---