猪圆环病毒2型体外刺激猪髋动脉血管内皮细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录分析

摘要：通过PCV2病毒感染猪髋动脉血管内皮细胞（PIEC）后炎症相关细胞因子mRNA转录水平变化，探讨PCV2感染诱导炎症产生的免疫机制。将PCV2病毒体外接种PIEC，感染不同时间后，收集样品，荧光定量PCR方法检测细胞因子IL-1β、IL-8及IL-18 mRNA转录水平的变化。结果显示，PCV2感染PIEC后，对促炎症细胞因子IL-1β、IL-18及趋化因子IL-8主要起上调表达作用。由此推测细胞因子在体内的综合效应会导致PCV2感染早期机体产生过度炎症反应，并趋化中性粒细胞，引发机体免疫抑制，影响机体特异性免疫应答的正常运转，为PCVD的发病创造条件。

关键词：猪圆环病毒2型；猪髋动脉血管内皮细胞；炎症相关细胞因子；荧光定量PCR；mRNA转录分析；免疫机制；促炎症细胞因子

中图分类号： S8582853文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0032-03[

收稿日期：2016-11-16

基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（编号：201303046）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（14）2045]；江苏省农业科学院基本科研业务专项-重大成果培育类[编号：ZX（15）1003]。

作者介绍：汪伟（1988—），男，安徽庐江人，硕士，助理研究员，主要从事兽用生物制品研究。Tel：（025）84391226；E-mail：weiwang054@126com。

通信作者：何孔旺，研究员。E-mail：kwh2003@263net。

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属成员，为无囊膜、单链负股DNA病毒，于1982年由Tischer等首次发现[1]，是目前发现最小的病毒之一，病毒颗粒直径为12～23 nm[2]，其中猪圆环病毒2型（PCV2）对猪群具有致病性。目前，PCV2已成为影响全球养猪业最重要的疾病之一，是猪圆环病（PCVD）的主要病原[3]。PCV2单独感染猪群很少引起临床发病[4]，而使猪群处于亚临床感染状态[5]；临床上常与猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）及猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）混合感染[6-7]。

在PCVD中PCV2影响机体的免疫系统功能的发挥，从而产生免疫抑制[8]，给全世界养猪业造成了重大的经济损失[9]。在PMWS猪中存在肉芽肿性炎症和多核巨细胞，表明细胞因子分泌及其他免疫相关信号分子在该过程中发挥着重要作用。目前，在基因、蛋白水平上，通过在体内体外研究发现PCV2感染后对各种细胞因子产生影响，特别是炎症相关细胞因子如IL-1β、IL-8、IL-18、TNF-α等，以及免疫调节因子IL-10、IFN-γ等；PCV2与其他病原共感染后对组织细胞的细胞因子也产生影响。通过PCV2对细胞因子产生影响的研究，来阐明PCV2感染对机体免疫系统的影响及引起免疫抑制的相关机理。

PCV2感染猪体后，可引起病毒血症[10]；PCV2在血液内通过血液循环与血管内皮细胞相互作用，并引起血管内皮细胞分泌细胞因子，极少量的细胞因子即可在体内发挥重要的免疫作用。因此，研究PCV2与血管内皮细胞相互作用引起的細胞因子变化具有重要的意义。本研究旨在探讨PCV2病毒感染猪髋动脉血管内皮细胞（pig iliac endothelial cells，PIEC）后对部分炎症相关细胞因子转录水平的影响。

1材料与方法

11试剂与仪器

1640细胞培养液（Invitrogen公司），猪髋动脉血管内皮细胞（PIEC）（中国科学院生化细胞所细胞库），2×SYBR Premix Ex Taq（大连TaKaRa公司），细胞RNA提取试剂盒（北京天恩泽科技公司），DNase Ⅰ（大连TaKaRa公司），5×qRT SuperMix反转录试剂盒（Biouniquer Technology公司）、ABI 7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

12病毒

PCV2病毒为笔者所在实验室自行分离并鉴定，并在 PK-15细胞体外传代58代后收获的细胞毒，间接免疫荧光法（IFA）测定其TCID50为10-625 mL。

13PIEC的培养

PIEC培养于含10%血清的1640细胞培养液中，长至单层细胞。将已长满单层的细胞用细胞培养液制成细胞悬液（细胞密度为50×105 mL）接种至6孔细胞培养板，每孔 2 mL。置37 ℃、5% CO2下培养24 h。

14病毒感染细胞

将6孔板上的细胞用1640培养液（无血清）清洗2次后，每孔接种病毒液2000 μL，补加1640维持液（5%血清）18 mL，共3个重复。另3孔只加20 mL 1640维持液（5%血清），作为细胞因子自然转录对照组。置37 ℃、5% CO2下分别作用24、48、72、96 h。

15细胞总RNA的提取与反转录

在各时间点分别取出细胞板，按细胞RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，得到的RNA按照DNase Ⅰ说明书进行基因组去除，按反转录试剂盒说明书进行反转录。200 μL 反转录体系：5×qRT SuperMix 40 μL，总RNA 80 μL，RNase free ddH2O 80 μL。反转录程序：250 ℃ 10 min，420 ℃ 30 min，850 ℃灭活5 min。获得cDNA，置 -20 ℃ 冰箱备用。

16荧光定量PCR法检测样品各细胞因子的cDNA拷贝数

用已经建立好的检测各细胞因子（IL-1β、IL-18、IL-8）的荧光定量PCR方法[11]检测各细胞因子的cDNA拷贝数。Real-time PCR经优化，250 μL反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq 125 μL，上、下游引物（10 μmolL）各 05 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）05 μL，cDNA模板 10 μL，ddH2O 100 μL。最佳反应程序：950 ℃ 30 s；950 ℃ 5 s，600 ℃ 34～60 s（表1），40个循环。每一循环结束时读取荧光信号，总循环结束后，加入熔解曲线分析步骤。将各细胞因子基因的拷贝数除以同1样本中β-actin基因的拷贝数，获得1个相对比值，即为细胞因子mRNA相对转录水平。

17统计分析

病毒组与对照组mRNA相对转录水平通过倍数改变量（fold change，FC）比较，FC≥20或FC≤05时，表明倍数改变有意义。对倍数改变有意义的数据在SPSS 22软件下采用独立样本t-检验进行统计分析，以P<005表示差异显著，P<001表示差异极其显著。

2结果与分析

21PCV2对PIEC的IL-1β mRNA转录水平的影响

IL-1β是一种重要的促炎症细胞因子，能诱导出与 TNF-α相似的生理和代谢改变，并能与TNF-α产生相互协同作用，介导病毒感染后机体的炎症反应与免疫调节中起重要作用。PCV2感染细胞后，除48 h时IL-1β出现下降（FC<05，P<005）外，24 h（FC>2，P<005）、96 h（FC>2，P<001）时IL-1β转录水平均显著升高。说明PCV2感染PIEC后，总体上会促进细胞IL-1β的转录，从而进一步影响机体的炎症反应（图1）。

22PCV2对PIEC的IL-8 mRNA转录水平的影响

IL-8是一种白细胞趋化性细胞因子，可以促进炎症细胞趋化和诱导细胞增殖，也是一种重要的促炎症细胞因子。在PCV2感染细胞24 h（FC>2，P<001）、96 h（FC>2，P<005）时，IL-8转录水平均显著升高。而在48、72 h变化不显著。说明PCV2感染PIEC后，总体上会促进细胞IL-8的转录，进而影响病毒复制及机体炎症反应（图2）。

23PCV2对PIEC的IL-18 mRNA转录水平的影响

IL-18是一种重要的免疫调节因子，诱导IFN-γ产生，增强IL-12的作用，具有抗微生物感染的作用。在PCV2感染细胞24 h（FC>2，P<001）、72 h（FC>2，P<005）、96 h（FC>2，P<005）时，IL-18转录水平均显著升高。IL-18与IL-1β具有类似的生物学功能，均能够促进机体炎症反应，并具有一定的协同作用（图3）。

3讨论与结论

PCVD是由猪圆环病毒2型造成的一种消耗性疾病，给世界养猪业造成了严重的经济损失[12]。PCV2病毒感染猪体，产生病毒血症，引起免疫抑制，对猪体的免疫机能产生严重的不良影响。细胞因子在调节免疫系统的免疫应答中起重要作用[13]。本试验研究PCV2病毒在不同时间内对PIEC细胞因子IL-1β、IL-8和IL-18的mRNA转录水平的影响；发现PCV2感染PIEC后，IL-1β、IL-8和IL-18主要表现上调作用。IL-1β、IL-18均是机体中重要的促炎症细胞因子，在介导机体炎症反应和抗微生物感染中起重要作用。炎症反应在一定程度上是机体对病原微生物感染后的免疫反应，是机体的一种自我保护机制；但过度的炎症反应会引起机体的免疫紊乱与免疫抑制[14]。IL-8是机体内重要的趋化因子，吸引、募集白细胞（主要是中性粒细胞），是机体产生炎症反应重要的因素之一。

由于PCV2对感染猪的免疫系统产生抑制作用，许多研究者选择细胞因子途径研究其致病机理。Li等用DNA芯片技术分析PCV2感染的猪肺泡巨噬细胞（PAM）多种免疫相关因子的转录变化，发现感染后24、48 h，IL-1β、IL-8和IL-18上调表达[15]。Chae等研究PCV2引起猪呼吸道疾病时的猪肺脏促炎症细胞因子表达情况，发现IL-1α和IL-8 mRNA轉录显著升高[16]。Borghetti等研究感染PCV2的猪外周血单个核细胞（PBMC）时发现，IL-1β（20周龄）和IL-8（20、22周龄）PCV2感染组显著低于阴性对照组[17]。Sipos等研究发现，自然感染的PMWS猪与阴性对照组比较，IL-1β上调表达[18]。Zhang等研究PCV2与猪肺炎支原体共感染时发现，当PCV2单独感染时，感染组支气管淋巴结的细胞因子IL-1β、IL-8高于阴性对照组[19]。王永帅等研究发现，PCV2单独感染猪肺泡巨噬细胞后能促进IFN-γ的表达，并在感染早期促进 TNF-α的表达[20]。

本试验研究PCV2在不同时间内对PIEC部分炎症相关细胞因子mRNA转录水平的影响，发现PCV2感染PIEC后，对促炎症细胞因子IL-1β、IL-18及趋化因子IL-8主要起上调表达作用。推测细胞因子在体内的综合效应导致PCV2感染早期机体产生过度炎症反应，并趋化中性粒细胞，引发机体免疫抑制，影响机体特异性免疫应答的正常运转，为PCVD的发病创造条件。

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