凉血解毒方及拆方对活化T淋巴细胞致角质形成细胞增殖及分泌细胞因子的影响

材料和方法

1.1 动物 Wistar大鼠，雄性，体重（200±20） g，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK（京）2009-0007。

1.2 细胞 Jurkat E6-1 T淋巴细胞株购于中国医学科学院基础医学研究所协和细胞资源中心；角质形成细胞Colo-16细胞株获赠于北京中医药大学附属东直门医院。

1.3 药物和试剂 凉血解毒方由首都医科大学附属北京中医医院制剂室提供，颗粒剂型。DMEM培养液、胎牛血清（FBS）（Gibco公司）；胰蛋白酶、噻唑兰（MTT）（Ameresco公司）；佛波醇酯（PDB，Sigma公司）；CD69抗体、IgG抗体（BD公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、可溶性细胞间黏附因子（sICAM-1/CD54）、干扰素-γ（IFN-γ）ELISA检测试剂盒（eBioscience公司）。

1.4 仪器 全波长酶标仪（美国Thermo公司）；离心机3-18K（美国Sigma公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；流式细胞仪（美国BD公司）。

2 方法

2.1 凉血解毒方及凉血方、解毒方含药血清的制备 Wistar鼠40只，体重（200±20） g，随机分为4组，按以下分组给予相应药物：空白组为生理盐水；凉血解毒方组为板蓝根、白茅根、羚羊角粉、茜草、紫草、生地黄、赤芍、熟大黄；凉血方组为白茅根、茜草、紫草、赤芍、生地黄；解毒方组为板蓝根、紫草、熟大黄、羚羊角粉。药物剂量为0.6 g·kg^-1（根据临床等效剂量换算），每日给药2次，连续5 d，最后一次给药后1～2 h（灌药前禁食不禁水12 h）腹主动脉取血，静置2 h后，3 000 r·min^-1离心10 min，无菌条件下分离血清。将每组血清混匀分装，56 ℃，30 min灭活，-20 ℃保存备用。

2.2 流式细胞仪测定T淋巴细胞的早期活化标志分子CD₆9 将T细胞以5×10⁵个/mL种于培养瓶中，加入PDB 2×10^-7 mol·L^-1作用24 h后，2 500 r·min^-1离心10 min，用PBS清洗1遍，加CD₆9（并做同型对照），4 ℃孵育20 min，用PBS清洗2遍，采用流式细胞仪进行检测。

2.3 MTT法测定凉血解毒方及拆方对Colo-16细胞增殖的影响 将Colo-16细胞以2×10⁴个/mL接种于96孔板，细胞融合近80%后，按如下分组进行：空白组（无血清培养液）、空白血清组（10%空白血清）、凉血解毒方组（10%凉血解毒方血清）、凉血方组（10%凉血方血清）、解毒方组（10%解毒方血清），细胞与含药血清共同作用24 h后，进行指标检测。

2.4 MTT法测定凉血解毒方及拆方对活化T淋巴细胞诱导Colo-16细胞增殖的影响 将Colo-16细胞以2×10⁴个/mL接种于96孔板，细胞融合近80%，加入T淋巴细胞（细胞密度为5×10⁵个/mL）和PDB 2×10^-7 mol·L^-1。按如下分组进行：空白组（无血清培养液）、T细胞活化组（T淋巴细胞+PDB）、空白血清组（T淋巴细胞+PDB+10%空白血清）、凉血解毒方组（T淋巴细胞+PDB+10%凉血解毒方血清）、凉血方组（T淋巴细胞+PDB+10%凉血方血清）、解毒方组（T淋巴细胞+PDB+10%解毒方血清），共同作用24 h后进行指标检测。实验结束后，弃去培养上清，加入100 μL培养液和10 μL MTT（5 g·L^-1），孵育4 h后在酶标仪492 nm处检测细胞增殖，以A表示。

2.5 ELISA法测定凉血解毒方及拆方对活化T淋巴细胞诱导Colo-16细胞分泌细胞因子的影响 将Colo-16细胞以2×10⁴个/mL接种于24孔板，分组同2.4项，实验结束后，取培养上清3 500 r·min^-1离心10 min，用ELISA试剂盒检测TNF-α，sICAM-1，IFN-γ，按说明书进行操作。

2.6 统计方法 实验数据以±s表示，用SPSS 15.0分析软件进行统计分析。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行组间差异性比较，P<0.05为具有统计学意义。

3 结果

3.1 T淋巴细胞早期活化标志分子CD₆9的表达 流式细胞仪检测PDB刺激T淋巴细胞24 h后，CD₆9活化率为95.64%，与同型对照的27.78%相比，证实T淋巴细胞呈高度活化状态。

3.2 凉血解毒方及拆方对Colo-16细胞增殖的影响 结果显示，凉血解毒方及拆方含药血清和空白血清在10%浓度下作用Colo-16细胞24 h后，对Colo-16细胞的增殖无促进或抑制作用。

3.3 凉血解毒方及拆方对活化T淋巴细胞致Colo-16细胞增殖的影响 活化T细胞作用于Colo-16细胞，与空白组相比，能够明显促进细胞增殖（P<0.01），与空白鼠血清相比，凉血解毒方各组血清均对活化T细胞致Colo-16增殖有明显的抑制作用，其中全方组和凉血组有显著差异（P<0.01），结果见表1。

表1 凉血解毒方及拆方对活化T细胞致Colo-16细胞增殖的影响（±s，n=8）

Table 1 Effect of CBDP and its different ingredients on Colo-16 proliferation induced by activated T lymphocytes （±s，n=8）

3.4 ELISA法测定凉血解毒方及拆方对活化T细胞致Colo-16细胞分泌细胞因子的影响 活化T细胞作用于Colo-16细胞24 h后，细胞因子sICAM-1，TNF-α，IFN-γ均明显升高，其中sICAM-1，TNF-α有统计学意义。凉血解毒方可明显降低sICAM-1，TNF-α，IFN-γ，而凉血方组和解毒方组对sICAM-1，TNF-α，IFN-γ均有不同的抑制作用，结果见表2。

4 讨论

银屑病具有多基因遗传背景，涉及到免疫、炎症、细胞增殖与凋亡、神经递质等多方面因素，最主要的症状表现为表皮过度增殖、角化不全、真皮血管膨大扭曲、大量免疫细胞浸润。目前银屑病发病机制尚无定论，普遍认为银屑病的发生是免疫系统失衡和角质形成细胞异常共同作用的结果[6]。

T淋巴细胞活化后释放大量的细胞因子，如

表2 凉血解毒方及拆方对活化T细胞致Colo-16细胞分泌细胞因子的影响（±s，n=4）

Table 2 Effect of CBDP and its different ingredients on Colo-16 cytokine secretion induced by activated T lymphocytes（±s，n=4）ng·L^-1

IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8和IL-10，可诱导KC产生HLA-DR抗原、细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1或CD₅4），通过淋巴细胞功能相关抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）/ ICAM-1途径介导KC与T 细胞之间的黏附，进一步形成T 细胞与KC间相互作用的恶性循环。ICAM-1是LFA-1的配体，正常情况下，很少表达或者不表达，当受到炎症细胞因子刺激后表达于KC表面，参与黏附作用的调节，促进局部浸润免疫反应的白细胞介导的黏附，并可使这些细胞的活化。IFN-γ被认为是KC最强的激活剂，IL-17和IL-4能增强IFN-γ诱导KC表达ICAM-1[7]。TNF-α主要由巨噬细胞和活化的T细胞产生，具有免疫调节作用，培养的KC释放TNF-α可诱导ICAM-I的表达，从而提供中性粒细胞与淋巴细胞的黏附位点，对淋巴细胞迁移进入表皮起重要作用。

中医认为，银屑病以热为主，病位在血分，血热是发病的关键因素和主要根源，因此，清热凉血解毒是治疗银屑病的基本方法。凉血解毒方（板蓝根、白茅根、羚羊粉、茜草、紫草等）是北京中医医院在凉血活血汤的基础上经过改进工艺研制而成的院内制剂（批准文号Z20050004），功能清热凉血、活血解毒。凉血解毒方针对血热型银屑病，可显著改善患者皮损，以及口干舌燥、心烦易怒、大小便异常等临床伴随症状，总有效率为62.5%。凉血解毒方含药血清均可使活化的T淋巴细胞数量明显下降，且排除药物毒性作用。不同剂量的药物均可显著降低T淋巴细胞活化标志CD₆9的表达，并且可抑制T细胞分泌TNF-α[8]。采用HPLC法检测大鼠灌服凉血解毒方后血清中含有芍药苷和茜草素[9]。

为了更好的研究银屑病发病机制中T淋巴细胞与角质形成细胞之间的关系，作者采用体外实验建立2种细胞共同培养体系来观察两者之间的相互作用以及凉血解毒方的影响。CD₆9是T细胞早期活化的主要标志，采用佛波醇酯（PDB）刺激T细胞24 h，观察其CD₆9活化率为95.64%。

首先观察10%的凉血解毒方及拆方含药血清和空白血清在对Colo-16细胞的增殖无促进或抑制作用。经过PDB刺激后的活化T淋巴细胞诱导Colo-16细胞显著增加，有统计学意义。凉血解毒方具有明显的抑制作用，其中全方组和凉血组差异显著（P<0.01）。活化T细胞作用于Colo-16细胞24 h后，细胞因子sICAM-1，TNF-α，IFN-γ均明显升高，其中sICAM-1，TNF-α有统计学意义。凉血解毒方全方和凉血方、解毒方均可明显降低sICAM-1，TNF-α，IFN-γ，而全方组药效最为显著。由此可见，凉血解毒方，可通过抑制sICAM-1抑制T淋巴细胞黏附，降低TNF-α和IFN-γ的分泌，产生抑制角质细胞增生的作用，凉血方和解毒方单方与全方组相比，作用略低于全方，两者无明显差异，研究结果证实凉血类和解毒类中药共同奏效，从而抑制银屑病的凉血解毒方中凉血类中药与解毒类中药共同奏效，具有抑制角质形成细胞增殖和细胞因子分泌的作用，凉血中药可能在银屑病治疗过程中发挥主要作用，是其不可或缺的重要组成部分。凉血解毒方抑制活化T细胞致角质形成细胞增殖的作用机制仍有待于进一步探讨。

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[3] 周冬梅，王萍.凉血活血汤治疗进行期银屑病140例临床观察[J].北京中医，2000，3：23.

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[9] 王小婷.凉血活血胶囊质量控制及有效成分药代动力学研究[D].长春：吉林大学， 2012.

Effect of blood cooling and detoxification formula and its dismantled

formulae on keratinocyte proliferation induced by activated T lymphocytes

XIE Xin-ran， LIU Xin， WANG Yan， ZHANG Lu， LI Ping

（Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University，

Beijing Institute of Chinese Medicine， Beijing 100010， China）

[Abstract] Objective： To observe the effect of the blood cooling and detoxification formula and its dismantled formulae on activated T lymphocytes-induced keratinocyte proliferation and cytokine secretion.Method： Rat drug-containing serum was prepared.PDB-stimulated T lymphocytes and Colo-16 cells were co-cultured， then added with the drug-containing serum， and laid aside for 24 h.The cell proliferation was detected by MTT assay.Cytokines TNF-α， sICAM-1 and IFN-γ were detected by ELISA.Result： The blood cooling and detoxification formula has a notable inhibitory effect on activated T lymphocyte-induced Colo-16 keratinocyte proliferation， with a significant difference between the whole formula group and the blood cooling group （P<0.01）.After activated T lymphocytes had added into Colo-16 cells for 24 hour， sICAM-1， TNF-α and IFN-γ significantly increased.Though the whole blood cooling and detoxification formula， the blood cooling formula and the detoxification formula could notably reduce sICAM-1， TNF-α， IFN-γ， the whole formula group showed the most significant effect.Conclusion： The blood cooling and detoxification formula， as an effective traditional Chinese medicine compound for clinical treatment of psoriasis， can significantly inhibit activated T lymphocyte-induced keratinocyte proliferation and cytokine secretion.

[Key words] psoriasis； T lymphocyte； colo-16 cell； blood cooling and detoxification formula

doi：10.4268/cjcmm20132231

[责任编辑 张宁宁]

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