中药复方艾可清加味对艾滋病模型猴不同组织CD4分子表达量的干预作用

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1.1材料与仪器

1.1.1动物中国产恒河猴16只，全部为雄性。体重4～7kg，猴龄3～5岁之间，由广东灵长类实验动物中心提供，许可证编号：SCXK粤2009-0025。试验前经血清学检测SIV、猴逆转录D型病毒（SRV）、猴T淋巴细胞I型病毒（STLV-I）和B病毒抗体阴性，结核菌素阴性，痢疾菌素阴性。以蒸馏水及标准猴饲料喂饲于GLP认证的灵长类动物实验室。本实验经广东省灵长类动物实验中心动物伦理委员会批准（文件编号： K09004-IACUC），实验严格按照广东省灵长类动物实验中心标准操作/作业流程执行，并按照K09004-IACUC文件中内容给予相应的动物福利。

1.1.2感染毒株与途径SIVmac239（中国科学院昆明动物所郑永唐博士馈赠），5MID100（5个100%猴感染剂量）1ml静脉注射。

1.1.3药物在临床观察和艾滋病模型猴实验证实有效的艾可清复方[4-5] 基础上加味，具体组成如下：红参10g，黄芪20g，白术15g，茯苓10g，当归10g，藿香10g，木香6g，葛根6g，虎杖15g，毛冬青15g，黄芩10g，紫草10g，淫羊藿15g，骨碎补10g，丹参15g，炮附子6 g，甘草6g，制成浸膏，置于4℃冰箱保存备用。替诺福韦注射夜（国药准字批号：GS-1278，吉利德科学公司），4℃冰箱中保存备用。

1.1.4试剂蛋白提取液（碧云天生物）；十二羟硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS，广州浩玛）；二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT，Sigma）；甘油（glycerol，广州浩玛）；丙烯酰胺（Acrylamide，Sigma）；N，N′-亚甲基丙烯酰胺（Bis-Acrylamide，Sigma）；四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED，广州浩玛）；过硫酸铵（ammomium persulfate，AP，广州化学试剂厂）；甘氨酸（Glycine，广州浩玛）；Tris碱（Trisbase，Sigma）；甲醇（methanol，广州化学试剂厂）；吐温-20（Tween-20，Sigma）；脱脂奶粉（BD）；PVDF膜（BIO RAD）；内参抗体（广州浩玛生物）；CD4分子一抗（Abcam公司）；HRP标记二抗（武汉博士德）。

1.1.5实验仪器超声细胞破碎仪（上海天呈科技有限公司）；垂直电泳仪及转移系统（BIO RAD）；射线摄影暗匣（5X7英寸，富士X光片，发光暗盒，广州浩玛生物）；脱色摇床（Rotomix 公司）；SW-CJ-IFD 型单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；5810R型低温超速离心机（德国EPPENDORE 公司）；JA1203 型电子天平（上海天平仪器厂）。

1.2方法

1.2.1艾滋病猴模型制作及分组给药健康中国恒河猴16 只，随机分为正常对照组4只，艾滋病模型组12只。其中健康对照组不做任何处理，仅作为健康对照使用；艾滋病模型组以氯胺酮7mg/kg麻醉后经静脉接种SIVmac239病毒株5MID100（5个100%感染剂量）1ml制作模型，通过外周围血病毒裁量和CD4+T淋巴细胞检测确定造模是否成功。艾滋病模型组12只再分为3个亚组，其中模型组4只，给予生理盐水灌胃；中药组4 只，给予中药制成悬浮液灌胃，给药剂量为1g/（kg·d）（1g=13g生药）；阳性药物组4只，替诺福韦按照30mg/kg的剂量，1次/d，皮下注射于动物背部；造模71d之后开始给药，连续给药8周，停药观察2周。实验结束后，全部动物以氯胺酮7mg/kg 麻醉后股动脉放血处死，解剖后取胃、十二指肠、回肠、结肠、直肠、肠系膜淋巴结、脾、浅表淋巴结组织分管装好，放入液氮中保存备用。

1.2.2Western 印迹分析将组织加入组织裂解液，进行组织蛋白定量；将定量裂解后的细胞样品取100μl加入5X蛋白上样缓冲液25μl，总上样量为25μg总蛋白；将样品放入沸水中8min使蛋白变性然后10000rpm离心5min；样品处理好后即可进行上样，加样量25μl；继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约0.5cm；将电泳结束后的胶片放入转印缓冲液中，将转印膜也放入转印缓冲液中浸润，进行转膜；封闭完毕后用PBST洗膜5次，每次间隔5min；加一抗，反应1.5h，洗膜5次每次间隔5min；加辣根过氧化物酶标记二抗，按说明书要求的稀释比例加入，反应1h，洗膜5次每次间隔5min；取ECL荧光底物（货号：37071，Pierce公司）A液和B液各1ml，混匀后，将PVDF膜浸泡其中，室温孵育3～5min后，用滤纸将PVDF膜表面液体擦干，并将其置于暗室，取医用X光底片覆盖，曝光1min后，依次显影、定影即可。以GAPDH （甘油醛-3-磷酸脱氢酶）作为内参。电泳条带经Image J 软件处理，分析各实验组条带与对照组条带面积、灰度比值。

1.2.4统计学方法采用SPSS 19.0 统计软件对实验数据进行统计学处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用多组重复测量设计资料的方差分析，若方差不齐用秩和检验，P<0.05表示有统计学意义。

3结果

与正常对照组比较，模型组各组织的CD4 表达量均有下降，下降最多的是肠淋巴结组织25.33%，下降最少的为十二指肠组织5.06%，其中回肠组织下降23.26%；与模型组比较，中药组CD4 表达量均有不同程度升高，升高最多为回肠组织，升高54.55%；同时阳性药物组CD4表达量也有一定升高。说明中药复方可以增加CD4的表达量，调理免疫功能，对艾滋病猴有一定治疗作用。详见表1。

表1艾滋病模型猴不同组织中CD4分子表达情况（单位：灰度比值）

n胃十二指肠回肠结肠直肠肠淋巴结脾浅表淋巴结

正常对照组40.91±0.000.79±0.000.86±0.000.89±0.000.87±0.000.94±0.001.11±0.000.95±0.03

模型组40.77±0.03*0.75±0.020.66±0.00*0.83±0.130.77±0.060.75±0.040.95±0.000.83±0.08

中药组40.86±0.040.83±0.071.02±0.07#0.98±0.091.06±0.030.97±0.020.97±0.030.93±0.05

阳性药物组40.92±0.05△0.77±0.080.87±0.120.94±0.091.02±0.020.87±0.01△0.91±0.030.84±0.00

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，*P<0.05，与中药组比较，ΔP<0.05。

4讨论

CD4分子是一类相对分子质量约为55000的单链跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，主要表达于部分T细胞、胸腺细胞、某些B细胞和EB病毒转化的B细胞、单核-巨噬细胞以及特定区域的脑细胞表面[3] 。CD4分子能协助机体免疫系统进行免疫防御、免疫自稳和免疫监视，与众多疾病的发生发展密切相关。CD4作为一种共受体分子，通过其胞外段与MHCⅡ、TCR相互作用，形成CD4-MHCⅡ-TCR复合物，介导特异性抗原呈递；而其胞质段则通过与酪氨酸激酶P56Lck的相互作用，介导抗原信号传递，最终激活CD4+T细胞，引发一系列的免疫应答。另外，CD4自身的多聚化不仅促进与MHCⅡ、TCR的相互作用，而且增强T细胞抗原识别的特异性和敏感性[6] 。HIV病毒通过以CD4分子为第一受体，进入细胞表面表达CD4分子的T细胞、胸腺细胞、某些B细胞和EB病毒转化的B细胞、单核-巨噬细胞以及特定区域的脑细胞，进而破坏细胞，造成胞免疫功能严重缺陷，导致各种机会性感染、恶性肿瘤及中枢神经系统退行性变的临床综合征。

艾滋病在中医古典医籍中并无此病名，根据其临床表现的特点，多数医家将其归于“伏气温病”或者“虚劳”的范畴，其病机特点为本虚标实[7]。本虚即为诸脏腑气血阴阳亏虚，其中以脾肾亏虚为主，而标实主要是热毒邪气互结。因此我们认为，脾虚、肾、疫毒是艾滋病发病的主要原因，三者之间相互为患，形成邪毒伤正，正不胜邪，本虚标实夹杂证。以此为据，拟用益气健脾补肾、清热解毒中药复方治疗本病。药物由本研究所前期研究成果之一的艾可清[4-5] 和传统古方七味白术散组成。方中人参、黄芪补中益气健脾，扶正以固本；藿香、木香、葛根斡旋中焦气机，恢复脾胃升清降浊功能；虎杖、毛冬青、黄芩、紫草清热解毒以治标；淫羊藿、骨碎补、炮附子补肾温命门之火，并且能温煦脾土；丹参、当归补血活血，预防久病气滞血瘀，甘草调和诸药。免疫印迹结果显示艾滋病模型猴的胃、十二指肠、回肠、结肠、直肠、肠系膜淋巴结、脾、浅表淋巴结织组中CD4表达水平中药组均数值与模型组比较分别升高了11.69%、10.67%、54.55%、15.31%、27.36%、22.68%、2.11%、10.75%，升高最多为回肠组织，升高54.55%。综上所述，当SIV感染恒河猴发病后，CD4的表达量显著减少，导致免疫功能低下。实验结果初步表明，中药复方艾可清加味可以提升CD4的表达，从而改善免疫功能，对猴艾滋病有一定治疗作用。

参考文献

[1] Ramirez-Amador V，Nittayananta W，Magalhaes M，et al.Clinical markers ofimmunodeficiency and mechanism of immune reconstitution inflammatory syndrome andhighly active antiretroviral therapy on HIV：workshop 3A[J] .Advances in dentalresearch，2011，23（1）：165.

[2] Reimann K A，Li J T，Voss G，et al.An env gene derived from a primary humanimmunodeficiency virus type 1 isolate confers high in vivo replicative capacity toa chimeric simian/human immunodeficiency virus in rhesus monkeys[J] .Journal ofvirology，1996，70（5）：3198.

[3] 胡迪超，张爱华，杨晓明.人CD4分子及其治疗性抗体的研究进展[J] .中国生物制品学杂志，2010，23（8）：896-900.

[4] 张苗苗，符林春，蔡卫平，等. 艾可清胶囊对HIV感染者的疗效观察[J] .中华中医药学刊，2008，27（10）：2233-2236.

[5] 何金洋，符林春，沈强，等. 艾可清对猴艾滋病模型的治疗作用[J] .广州中医药大学学报，2011，27（6）：613-617.

[6] 崔健，肖鹤，冯健男，等. CD4分子功能表位及拮抗剂研究进展[J] .军事医学科学院院刊，2007，31（2）：170-174.

[7] 张苗苗，孙世辉，符林春.以外感为经、杂病为纬辨治艾滋病[J] .广州中医药大学学报，2008，24（5）：385-388.

（收稿日期：2015.02.27）

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