ＳＥＭＡ３Ｂ基因在鼻咽癌组织中的表达、杂合性丢失和甲基化分析

摘　要：SEMA3B基因定位于鼻咽癌高频缺失区域3p21．3上，最近被证明具有抑瘤基因的功能。分析了鼻咽癌组织SEMA3B基因的表达、杂合性丢失(LOH)和甲基化情况。首先应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测了33例鼻咽癌组织和15例慢性鼻咽炎组织中SEMA3B基因的表达，结果显示75．8％(25／33)鼻咽癌组织中SEMA3B基因表达缺失或下调，显著低于慢性鼻咽炎组织中的表达(P=0．001)。进一步选取3个微卫星位点D3S1568、D3S1621和D3S4597分析了20例鼻咽癌组织中SEMA3B基因LOH的情况，结果表明3个位点的丢失率分别为10％、20％和15％，总的丢失率为45％，统计分析发现LOH与基因表达之间存在明显相关(P=0．023)。最后，采用甲基化特异性PCR方法分析了SEMA3B基因启动子区甲基化，结果发现在100％的鼻咽癌组织和73．3％的慢性鼻咽炎组织中检测到SCMA3B基因启动子区高甲基化．由此得出结论，SEMA3B基因在鼻咽癌组织中表达缺失或下调，LOH是引起其表达异常的原因之一。

关键词：SEMA3B；鼻咽癌；抑瘤基因；杂合性丢失；甲基化

中图分类号：R739．6

文献标识码：A

文章编号：1007-7847(2006)02-0183-06

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种高发于我国南方且恶性程度较高的肿瘤，病因学研究表明其发生发展与遗传因素、EB病毒感染以及环境和饮食等多种因素密切相关。但是鼻咽癌致病的分子机制至今仍不十分清楚。有研究报道，在鼻咽癌中常发生染色体3p21．3杂合性丢失(10ssofheterozygosity，LOH)。进一步的功能学研究表明3p21．3上存在与鼻咽癌相关的抑瘤基因(tumorsuppressorgenes，TSGs)。SEMA3B基因(semaphorine 3B)定位于染色体3p21．3上，基因转染实验显示SEMA3B基因的再表达可以抑制癌细胞的生长、诱导癌细胞凋亡和降低裸鼠成瘤能力，被认为是候选抑瘤基因。

为了揭示候选抑瘤基因SEMA3B是否与鼻咽癌发生发展相关，本研究采用RT-PCR、LOH和甲基化特异性PCR((methylation-specific PCR，MSP)分别检测了鼻咽癌组织中SEMA3B基因的mRNA表达水平、等位基因丢失和启动子区甲基化情况。

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材料与方法

1．1 材料

1．1．1 标本

所有用来分析的鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织标本均取自湖南省肿瘤医院耳鼻喉科门诊患者。鼻咽癌组织标本54例：男30例，女14例；平均年龄48．2岁；有颈部淋巴结转移的患者40例；慢性鼻咽炎组织标本26例：男18例，女8例；平均年龄46．4岁。取材后一部分组织送常规病理检查以明确诊断，另一部分组织立即放人液氮中储存备用。同时收取了其中20例鼻咽癌患者的外周血标本用于微卫星位点LOH分析。所有患者均未经化疗、放疗和生物治疗。

1．2．1 主要试剂及仪器设备

TRIzol试剂购自美国Gibco／BRL公司、逆转录试剂盒购自美国Promega公司、广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒和热启动Taq酶购自日本TaKaRa公司、紫外分光光度计为德国Eppendoff公司产品、PCR仪为德国Biometra公司产品、VDS紫外凝胶摄像仪为美国Pharmacia公司产品。

1．2 方法

1．2．1 RNA抽提和半定量RT-PCR检测SE—MA3B基因的表达

按TRIzol试剂(Gibco／BRL)说明书提供的操作程序抽提组织总RNA。用DNaseI(10u／IxL)去除总RNA中的痕量基因组DNA。取1～2 txL经过DNaseI处理的RNA进行逆转录反应，反应条件为42℃90min，99℃5min。用1μLcDNA产物进行PCR扩增：95℃变性5min；95℃30s，56℃ 30s，72℃30s，循环32次；72℃延伸10min。扩增SEMA3B基因cDNA的上、下游引物分别位于SEMA3B基因第12外显子和第15外显子上，引物序列为：上游引物5＇－GTCCTCTTCATFGGCACAGAC-3＇，下游引物5＇-GTCGCCATTCCTYACGTCTT-3＇，产物大小为345bp；同时扩增看家基因GAPDH作为内对照，引物序列为：上游引物5＇—CCACCCATGGCAAATFCCATGGCA-3＇，下游引物5＇-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3＇，产物大小为550bp。取PCR产物8μL在1．0％琼脂糖凝胶(含0．5 mg／L溴乙啶)上电泳，紫外灯下观察，VDS凝胶成像仪上照像。通过凝胶图像分析软件Ban&can分析得出SEMA3B和GAPDH基因产物条带吸光度，计算SEMA3B吸光度／GAPDH吸光度的相对比值，该比值表示SEMA3B基因的相对表达强度。

1．2．2 基因组DNA的抽提

根据《分子克隆》(第三版)描述的基因组DNA抽提方法加以修改来抽提鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织基因组DNA，具体步骤如下：组织在液氮中研磨成粉末状，溶于0．5mLTris／ED-TA／SDS溶液中，60℃水浴30min；加入25μL蛋白酶K(2g／L)，37℃水浴过夜，然后通过酚／氯仿抽提，无水乙醇沉淀，最后溶解于无DNA酶的灭菌水中，－20℃保存备用。按照广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒(TaKaRa)的操作程序抽提配对外周血标本淋巴细胞基因组DNA。

1．2．3 微卫星位点杂合性丢失分析

以基因组DNA为模板通过PCR扩增SE—MA3B基因的3个微卫星位点D3S1568、D3S1621和D3S4597来分析鼻咽癌组织中SEMA3B基因LOH情况，引物序列均来自人类基因组数据库(http：//www．gdb．org/)。PCR反应参数为：95℃变性12min；94℃15s，60℃15s，72℃30s，循环10次；89℃15s，60℃15s，72℃30s，循环25次；72℃延伸10min．5μLPCR产物变性后上样于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离、银染、扫描后分析结果。当配对外周血淋巴细胞DNA的等位基因PCR扩增片段为杂合子时，可提供信息进行LOH分析。若肿瘤组织的一对等位基因PCR扩增片段缺少一条或其中一条的相对密度减少50％以上，认为有杂合性缺失。所有样本重复3次。

1．2．4 基因组DNA的亚硫酸盐修饰及甲基化特异性PCR扩增

基因组DNA的亚硫酸盐修饰包括DNA的变性、修饰、脱盐纯化和脱磺化等过程。在30μL基因组DNA(10μg)中加入3．3μL新鲜配制的

NaOH(0．3 mol／L)，混匀，37℃水浴变性15min；将新鲜配制的10mmol／L对苯二酚和3mol／L亚硫酸氢钠的混合液333μL加入变性的DNA中，55℃避光孵育4h；修饰的基因组DNA按照广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒(TaKaRa)操作步骤进行脱盐纯化处理；在脱盐纯化的DNA中加入5．5μL 3 mol／L的NaOH，室温静置5～10min，使其脱磺化基团，然后在2．5倍体积无水乙醇中－20℃过夜，沉淀，最后重新溶解于20μL无DNA酶的灭菌水中，－20℃保存备用。

MSP扩增原理：用亚硫酸盐修饰基因组DNA后，DNA中的胞嘧啶由于甲基化状态的不同保留为“C”(胞嘧啶被甲基化时)或改变为“T”(胞嘧啶未甲基化时)；分别设计甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物进行PCR扩增目的基因启动子区序列，就能检测出目的基因启动子区CpG岛甲基化情况。本研究中SEMA3B基因MSP扩增引物来自文献报道。PCR反应体系(20μL)中依次加入10×PCR缓冲液、0．25 mmol／LdNTPs、0．2μmol／L上游和下游引物、2μL亚硫酸氢钠修饰的DNA和0．5 unit热启动Taq聚合酶(TaKaRa)，反应的条件为：95℃变性10min；95℃30s，54℃30 s，72℃30 s，循环36次；72℃延伸10min。取10μLPCR产物在2．0％的琼脂糖凝胶上电泳分离，VDS凝胶成像系统照像。根据凝胶图像上相应条带的有无来判定各样品DNA中SE-MA3B基因启动子区甲基化状态，可分为完全甲基化、部分甲基化或非甲基化状态等3种情况。

1．2．5 统计学分析

采用SPSS11．0软件进行Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon rank sumtest)。p<0．05认为有统计学差异。

2　结果

2．1 SEMA3B基因在鼻咽癌组织中的表达缺失或下调

通过半定量RT-PCR方法，检测了鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中SEMA3B基因的mRNA表达水平。发现15例慢性鼻咽炎组织中全部稳定表达SEMA3B基因，但在33例鼻咽癌组织中仅有8例表达与慢性鼻咽炎组织相当的SEMA3BmRNA水平，表达缺失或下调率达75．8％(25／33)(图1所示)。刘晓琼等报道SEMA3B基因在76％(16／21)的鼻咽癌组织中表达下调或缺失，我们的结果与其基本一致。统计学分析显示SE—MA3B基因在慢性鼻咽炎和鼻咽癌组织中的表达差异有统计学意义，且鼻咽癌组织中的表达明显低于慢性鼻咽炎组织(p=0．001)(表1所示)；进一步分析SEMA3B基因在鼻咽癌组织中的mRNA表达水平和临床特征之间的关系，结果说明鼻咽癌组织中SEMA3B基因的表达水平与患者的性别和颈部淋巴结转移无相关性(p>0．05)(如表2所示)。

2．2 SEMA3B基因微卫星位点杂合性丢失分析

以基因组DNA为模板，通过PCR方法检测了20例鼻咽癌组织及其配对外周血标本中D3S1568、D3S1621和D3S45973个微卫星位点的等位基因情况，发现3个位点均存在LOH，丢失率分别为10％、20％和15％，SEMA3B基因微卫星位点总的LOH频率为45％，代表性LOH检测结果见图2。通过Wilcoxon秩和检验分析了LOH与基因表达水平之间的关系，提示SEMA3B基因的表达水平与其LOH存在相关(P<0．05)(如表3所示)，表明等位基因杂合性丢失是SEMA3B基因在鼻咽癌中表达异常的原因之一。

2．3 SEMA3B基因启动子区CpG岛甲基化分析

采用MSP方法分析了SEMA3B基因启动子区CpG岛甲基化情况，结果显示SEMA3B基因启动子区在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中均存在高甲基化现象，甲基化率分别为100％(33／33)和73．3％(11／15)(图3所示)，表明SEMA3B基因启动子区甲基化与其在鼻咽癌组织中的表达缺失或下调无明显因果关系，SEMA3B基因启动子区高甲基化可能并不参与鼻咽癌的发生发展。

3　讨论

SEMA3B基因编码由17个外显子组成的3．4kb的mRNA，其蛋白质由749个氨基酸组成，包括一个信号肽、一个高度保守的semaphorin结构域和一个免疫球蛋白样结构域，是一类分泌型或细胞膜结合型信号素(Semaphorins)分子大家族成员之一。Semaphorins分子除了在神经发育过程中引导轴突选择正确途径以到达靶区并建立突触联系之外，还具有淋巴细胞激活、血管内皮细胞迁移、肺支气管形态发生等作用，反映了这个家族成员功能的多样性。

最近，研究结果显示SEMA3B基因在大约80％的肺癌细胞系中表达下调或缺失，体外转染SEMA3B基因可诱导肺癌细胞凋亡，致使肺癌细胞集落形成率下降90％，说明SEMA3B基因与肺癌发生密切相关，也提示SEMA3B基因对恶性细胞的生长具有较强的抑制作用。此外，Ochik等还发现SEMA3B基因启动子区域含有p53蛋白结合位点，转录表达呈现出p53依赖性，提示SEMA3B基因可能参与了p53介导的抑癌通路。

我们发现SEMA3B基因在75．8％鼻咽癌组织中表达缺失或下调，明显低于慢性鼻咽炎组织(p=0．001)，与刘晓琼等报道的研究结果相似，提示SEMA3B基因可能在鼻咽癌的发生发展过程中起了一定作用。

为了探讨SEMA3B基因在鼻咽癌中表达缺失或下调的分子机制，我们进一步从遗传学和表遗传学方面进行了分析。首先，检测了用于基因表达分析的33例鼻咽癌组织中的20例标本的SEMA3B基因微卫星位点LOH情况，结果在9例鼻咽癌组织中存在SEMA3B基因等位基因丢失，而且统计学分析表明LOH与基因表达之间存在相关性(p=0．023)，说明LOH是SEMA3B基因在鼻咽癌中组织表达缺失或下调的分子机制之一。

DNA甲基化是表遗传学改变的主要方式，也被认为是抑瘤基因功能失活的一个普遍分子机制。在41％～47％的非小细胞性肺癌、83％肝细胞癌和100％胆管癌中发现SEMA3B基因启动子区存在高甲基化现象。在本研究中，我们发现SEMA3B基因启动子区在100％的鼻咽癌组织和73．3％的慢性鼻咽炎组织中都存在高甲基化现象，与预期结果不一致。我们推测SEMA3B基因启动子区高甲基化可能与炎症、衰老或其它的生理和病理现象有关，而与鼻咽癌的发生发展可能无关。DNA高甲基化，特别是抑瘤基因DNA的局部高甲基化虽然与肿瘤的发生发展有着密切的关系，但是越来越多的研究也发现在正常或慢性炎症上皮也存在有抑瘤基因的甲基化现象。如正常膀胱上皮、正常或慢性炎症结肠粘膜就存在抑瘤基因的甲基化，其甲基化程度与年龄的增长呈正相关，研究人员推测DNA甲基化至少可以分为两种类型，即肿瘤相关型甲基化(TypeC methylation)和衰老相关型甲基化(Tvpe Amethylation)cI。此外，Dammann等也发现肿瘤相关基因的启动子区甲基化在正常肺组织中存在，认为这可能与表遗传学缺陷、印迹或组织特异性甲基化有关。随着甲基化研究的不断深入，人们可能还会发现许多与甲基化有关的病理或生理现象。

综上所述，SEMA3B基因在鼻咽癌组织中表达下调或缺失，微卫星位点的等位基因丢失是其表达异常的分子机制之一。进一步分析SEMA3B基因在鼻咽癌组织中其它的遗传学改变(如基因突变等)、表遗传学改变(如组蛋白乙酰化等)及其功能，对确定SEMA3B基因是否与鼻咽癌发生发展相关有着重要的意义。

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