脂肪酶氧阴离子洞的研究进展

摘   要：随着脂肪酶在我们生产生活中的广泛应用，人们越来越多地使用生物技术手段对酶蛋白的分子结构进行改造，以改善不同来源脂肪酶的性质，获得更多满足人类需求的脂肪酶。氧阴离子洞是脂肪酶活性中心“口袋”附近的催化元件，因此，在脂肪酶的催化反应过程中，氧阴离子洞结构发挥着很重要的作用，也为此成为研究的热点。在过去的十多年里，人们更加关注对脂肪酶氧阴离子洞的研究并且取得了很大的进展，对此进行了研究和阐述。

关键词：脂肪酶;氧隐离子洞;催化元件

1    脂肪酶及氧阴离子洞简介

脂肪酶（EC 3.1.1.3） 又称三酯酰甘油酰基水解酶，是在油水界面中最具有活性的丙三醇酯水解酶。它们不仅能够催化水解反应还能催化长链酰基甘油的合成，在食品加工、洗涤、制药、化工等领域都被广泛的应用[1]。脂肪酶广泛存在于自然界中，但是从自然界中直接分离纯化得到的酶往往不能满足生活、工业生产的需要，因此，通过实验室改造获得高性能、强实用性的脂肪酶，已成为一种有效的途径。虽然不同脂肪酶的来源不同，并且它们的氨基酸序列也大不相同，但它们仍然有一些相同的结构。如都具有一个含有催化三连体（Ser-His-Asp/Glu）的催化中心[2];都具有一个特殊的序列-G X1 S X2 G-[3];都具有α/β水解酶折叠结构并且在一些其他的水解酶中它们的3-D折叠结构是相同的[4]。在脂肪酶未活化（处于水相或者有机相）时，其催化中心会被一个灵活的“盖子”盖住，阻止了底物与酶的活性中心接触。在油-水界面上时，脂肪酶存在一种“界面激活”的现象。即在油-水界面处，脂肪酶的盖子结构区域的构象会发生变化，从而使盖子结构被打开，活性中心暴露出来，底物顺利进入活性中心并与之结合，使脂肪酶的催化活性大幅度提升。当“盖子”打开的同时，氧阴离子洞也随之形成。氧阴离子洞是脂肪酶活性中心“口袋”附近的催化元件，由催化三连体中丝氨酸的侧链或两个主链酰胺基团组成[5]，在大多数情况下由来自两个主链酰胺结合羰基氧形成的氢键来稳定四面体中间产物[6]。根据氧阴离子洞的氨基酸组成，脂肪酶被分为3大类：GGG（X）- ，G（X）- 和Y-类[7]。依据一般分类，G（X）类由11个超家族和22个同源家族组成，其中包含376个蛋白质，具有6 004个序列和已知结构的125条链。该类主要包括细菌和真菌脂肪酶、真核脂肪酶、角质酶、磷脂酶和非血红素过氧化物酶。GGG（X）类由5个超家族和16个同源家族组成，包括430个蛋白质，具有767个序列和73个已知结构的链。它包括细菌酯酶、真核羧酸酯酶、激素敏感脂肪酶、乙酰胆碱酯酶和硫酯酶等。“南极假丝酵母脂肪酶A”超家族，由于构成CAL-A氧阴离子洞氨基酸残基为Tyr93，因此被分为Y型。它包含一个晶体结构，CAL-A和39个序列分配给32种蛋白质，它们都来自属于真菌界的微生物。

酶的催化活性除受外界环境（温度、pH、盐离子等）影响外，其自身的活性中心、“盖子”结构、酰基口袋、氧阴离子洞等结构也都会影响酶对底物的催化能力[8]。因此，氧阴离子洞作为影响酶活性的重要因素被人们关注。研究学者在对酶性质研究的过程中，不仅改变脂肪酶“盖子”结构的组成、铰链区的氨基酸种类和酰基口袋的大小，还改变组成脂肪酶氧阴离子洞的氨基酸残基。对组成脂肪酶氧阴离子洞氨基酸残基的改造旨在得到符合人们要求的脂肪酶突变体，并将该突变体在食品、制药、化工、洗涤剂等工业方面加以应用。

2    脂肪酶氧阴离子洞结构的组成及改造研究

2.1  关于脂肪酶氧阴离子洞结构的组成

氧阴离子洞作为影响脂肪酶催化活性的重要结构，成为人们研究的热点。众多研究发现，改变氧阴离子洞结构的氨基酸的组成，或者改变氧阴离子洞的类型，会对脂肪酶的底物特异性、热稳定性和催化活性等产生重大影响。人们对脂肪酶分子中氧阴离子洞结构组成的判断，主要通过基因序列分析、X-射线晶体衍射技术、同源建模、酶活性中心分析等方法。如通过X-射线晶体衍射技术和酶活性中心分析得出法德氏根霉脂肪酶和雪白根霉脂肪酶的氧阴离子洞都可能由羟基和主链上的Thr 83所构成[9]。Seizaburo Shiraga等[10]通过晶体分析得知，米根霉脂肪酶的氧阴离子洞可能由Thr 93 和Asp 94构成。MaevaSubileau等[11]通过同源建模并对此加以分析得出G181和D90可能是构成平滑假丝酵母脂肪酶A（CAL-A）氧阴离子洞的氨基酸残基。

2.2  脂肪酶氧阴离子洞结构的改造

氧阴离子洞結构在酶的催化过程中具有重要的价值。近年来，随着脂肪酶在生活中被广泛应用，并且为了得到具有耐低温、耐高温、具有立体选择性等特性的酶，人们对酶蛋白氧阴离子洞结构的改造研究日趋升温。研究学者对酶结构的改造策略常有理性设计和定向进化。目前，国内外学者主要用理性设计这种方法对氧阴离子洞（oxyanion hole）进行改造。理性设计分为定点突变和定点饱和诱变，是经常用于改造氧阴离子洞结构的一种方法[12-14]，其原理是依据脂肪酶的三维结构，利用生物信息学分析酶蛋白分子结构和功能的关系，然后运用定点突变技术完成氨基酸残基的替换[15]。

2.2.1  定点突变

定点突变是较早用于改造脂肪酶的分子生物学手段。目前，人们仍利用该手段在酶分子的稳定性、催化活性等方面进行成功的改造。为了研究角质酶分子中的Serine 42侧链在稳定四面体中间产物中的作用，Anne Nicolas等[5]通过定点突变的方法，将Serine 42突变为Ala，Asn84分别突变为Ala，Leu，Asp和Trp（因为Asn直接影响着Ser42Oγ恰当的方向）。结果显示，野生型脂肪酶的活性与改造后的S42A突变体相比增加了450倍，但后者三维空间结构没有发生改变。N 84 A和N 84 L突变体的活性及三维空间结构都没有改变，但N 84 W 和N 84 D突变体几乎丧失活性。表明Serine 42侧链和其周围的氨基酸残基共同稳定四面体中间产物;葡萄球菌CR53脂肪酶LipR有特殊的Y型氧阴离子洞序列，这在细菌脂肪酶中从未发现，为了探索这种不寻常的Y型氧阴离子洞结构在葡萄球菌CR53脂肪酶LipR催化活性中的作用。Belen Infanzon和Pablo H. Sotelo及其同事通过QuikChange®定点突变的策略[7]，将LipR Y型氧阴离子洞结构（YDS）转变为更接近细菌中那些最常见的GGG（X）结构。然而，在获得的所有突变体中，活性完全丧失，表明LipR的Y型氧阴离子洞在酶催化活化中起着至关重要的作用。Amanda Fillat等 [12]为了提高EstBP7转化TA酯的能力，就对-GGG（A）X-结构进行了定点突变，最终筛选到了一株，在4 ℃下对叔醇乙酸酯有很高对映选择性的突变株。这一研究对制药工业中有价值的光学纯叔醇的生物催化有很大的意义。定点突变具有明确的目标位置，用以定向改变脂肪酶某些结构的氨基酸组成进而使其酶学性质发生改变，如提高其热稳定性、改变其对底物的对映选择性等。经修饰改变后得到的脂肪酶更符合工业应用的需求，这是一种高效、简洁的突变方法。

2.2.2  定点饱和突变

定点饱和突变主要包括：聚合酶链式反应介导的定点突变、寡核苷酸引物介导的定点突变和盒式突变，其中最常用的方法是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）介导的定点突变。定点饱和突变是在酶与底物结合区内的位点上进行改造的主要策略，以改善有限的底物范围、活性不足和稳定性差等缺陷。该技术是在定点突变的基础之上发展起来的，虽然通过定点突变已经在获得具有改善催化性质的酶方面取得了许多成功，但仍然存在许多不确定性因素，因此，通过设计简并引物实现定点饱和突变的方法得到了广泛的应用。在简并引物的设计过程中，根据密码字的特点，最常用的系统为NNK，NDT，HCSM[16]，选择合适的简并引物系统，能够有效地缩小所需要筛选的文库，增加筛选的效率。Belen Infanzon[7]为了探究Y型氧阴离子洞在脂肪酶LipR催化活化中的作用，通过QuikChange®进行定点饱和诱变，用NNK简并密码子（N为A，T，G或C，K为G或T）替换目标密码子，构建脂肪酶LipR的Y110和D111位置可能编码所有氨基酸的两个基因文库。结果表明，当Tyr110被任何其他氨基酸取代时，获得的LipR突变体都不具有活性。而突变体LipR D111G在短链或中链底物上显示出比野生型LipR更低的活性，但在长链底物上的活性比野生型增加5.6倍。

3    结语

在实际的生产当中，脂肪酶的用途十分广泛，但其研发和应用受到许多因素的制约，如脂肪酶的选择性及催化机制、价格昂贵、回收困难、稳定性较差等。但随着科学技术的进步和微生物脂肪酶的高速发展，这些限制因素成为国内外学者研究脂肪酶的热门方向。人们越来越多地使用生物技术手段对酶蛋白的分子结构进行改造，以改善不同来源脂肪酶的性质，得到更多满足人类需求的脂肪酶，达到利于人们生活、社会生产和人与自然和谐相处的目的。

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Research progress of lipase oxyanion hole

Wu Qinqin， Su Min

（Life Science College， Fujian Normal University， Fuzhou 350008， China）

Abstract： With the wide application of lipase in our production and life， people are increasingly using biotechnology to modify the molecular structure of enzyme proteins to improve the properties of lipases from different sources and to meet more human needs. The oxyanion hole is a catalytic element near the “pocket” of the lipase active center. Therefore， the oxyanion hole  structure plays an important role in the catalytic reaction of lipase， and it is also a research hotspot. In the past ten years， people have paid more attention to the study of lipase oxygen anion holes and made great progress.This paper studies and expounds this experiment.

Key words： lipase; oxyanion hole; catalytic element

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