周期性牵张应力对人成骨细胞基因表达谱影响的初步研究

[摘要]目的：研究周期性牵张力对人成骨细胞基因表达谱的影响，为进一步研究机械应力状态下骨改建机理提供思路和线索。方法：通过体外细胞加载系统对培养的人成骨细胞施加8％形变率、6周/min的周期性牵张力24 h，应用基因表达谱芯片技术对人成骨细胞中的mRNA表达水平进行对比杂交分析，检测周期性牵张力加载组成骨细胞基因表达谱的变化。结果：在所分析的21 073条人类功能基因中，加载组与未加载组人成骨细胞之间差异表达显著的基因有2 498条，其中表达上调的有899条(2.0倍以上),表达下降的有1 599条(0.5倍以下)。这些基因表达产物涉及细胞信号转导、细胞周期调节等多个方面。结论：周期性牵张力对成骨细胞多种基因的表达产生了影响，成骨细胞的应力反应是一个复杂的，多基因参与调控的过程。这些变化的基因可能与成骨细胞的机械应力反应有关。

[关键词]周期性牵张应力；人成骨细胞；基因表达谱；基因芯片

[中图分类号]R783.5 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）10-1410-03

Experimental study of effects of cyclic tensile strain on gene expression profiles in human osteoblasts

QIU Jun,LI Yong-ming,LIN Zhu,CHEN Qiao-ling

(Department of Orthodontics，College ofStomatology,the Fourth Military Medical University，Xi"an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo study effects of cyclic tensile strain on gene expression profiles in human osteoblasts in vitro.MethodsHuman osteoblasts were cultured on flexible-bottomed plates and subjected to 8% elongation by strain unit at 6 cycles/min (i.e.5-s elongation and 5-s relaxation) for 24 hours in the experimental groups. Control group were not exerted any strain. Both of them were examined by gene expression profiles chip technology. Results A series of differentially expressed genes were found between experimental group and control group. 899 up-regulated and 1599 down-regulated genes were identified among the 2 498 differentially expressed genes.ConclusionThe results shows that the response ofhuman osteoblasts to cyclic tensile strain in gene level was complicate. These differentially expressed genes are necessary genes related to osteoblasts response to mechanical strain.

Key words:cyclic tensile strain；human osteoblast；gene expression profile； gene chip

成骨细胞(Osteoblast)是一种对应力敏感的细胞，来自多潜能的间充质干细胞，负责骨基质形成及钙化,在骨改建过程中起重要作用。大量研究表明[1-5]：成骨细胞在应力状态下，细胞活力、新陈代谢以及与细胞成骨有关的骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、表皮生长因子受体(epidermal growth receptor，EGFR)、细胞外基质等发生变化。但是以往的研究多限于一个或几个分子基因，难以全面系统地了解成骨细胞对机械力刺激的反应模式。因此，本研究利用基因表达谱芯片技术，比较全面地分析牵张应力条件下人成骨细胞功能活性的影响因素，研究周期性牵张力对人成骨细胞基因表达谱的影响，为进一步研究机械应力状态下骨改建机理提供思路和线索。

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器：DMEM培养液(Gibco，美国)；新生牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)；TRIZOL 试剂(Invitrogen,美国)；Agilent 人1A基因表达谱芯片（Agilent，美国）；cRNA扩增与标记试剂盒（Lifegen，美国）；芯片杂交试剂盒（Agilent，美国）；RNA纯化试剂盒(Qiage，美国）；芯片扫描仪（Axon 400B，美国）；Genepix3.0软件(General Scanning，美国)；多通道细胞牵张应力加载仪（第四军医大学口腔医学院）；6孔弹性膜培养板(Flexcell，美国)。

1.2 人成骨细胞培养及鉴定：经患者及其家长同意，取一名14岁女性儿童因正畸需要拨除下颌第三磨牙牙胚时去除牙槽骨块约0.5～1.0g，将组织放于盛少量小牛血清的培养皿中，用眼科剪剪碎成约1mm3大小。按酶消化法原代培养人成骨细胞，通过活体观察、碱性磷酸酶(ALP)染色、骨钙素免疫组织化学染色法鉴定所培养细胞为成骨细胞，取第5～8代细胞进行实验。

1.3 加载周期性牵张力：将第5代成骨细胞按1.5×105／孔接种到两块6孔弹性膜培养板上，培养24h，细胞在弹性膜底贴壁牢固，生长至约80%底壁面积，换含2%新生牛血清的DMEM培养液静置24h，再次换含2%新生牛血清的DMEM培养液。其中一块6孔弹性膜培养板作为实验组，应用多通道细胞牵张应力加载仪对培养在弹性膜培养板上的成骨细胞施加6周/min、8%形变率的周期性牵张力24h后收集细胞。另一块6孔弹性膜培养板作为对照组不加载机械力，在相同条件下培养24h后收集细胞。

1.4基因表达谱芯片分析分别取实验组与对照组人成骨细胞，加适量TRLzol匀浆，离心10min。取上清液加入氯仿，震荡后放置3min，向上清液中加异丙醇充分混匀再离心10min。加入两次75%乙醇离心弃上清，加入RNAse-free超纯水完全溶解RNA沉淀，-80℃保存。经预杂交后加入逆转录引物合成cDNA ,以Cy5标记实验组细胞cDNA，Cy3标记对照组细胞cDNA做探针，纯化后在Agilent Human 1A基因表达谱芯片上进行杂交。冲洗玻片晾干后以Axon 400B扫描仪扫描芯片荧光信号图像，用基因图像分析软件Genepix3.0对扫描图像进行数字化处理和分析。判断基因差异表达的标准为：①Cy3和Cy5信号比值的自然对数的绝对值(Ratio)>0.69(基因的表达变化在2倍以上)；②Cy3和Cy5信号值其中之一必须大于800。

2结果

2.1 总RNA提取结果：人成骨细胞总RNA凝胶电泳可见mRNA 18S、28S条带清晰（如图1）。紫外分光检测分析显示，实验组与对照组人成骨细胞总RNAOD260/OD280>1.9，说明提取RNA的纯度和完整性达到要求。

2.3 基因芯片杂交信号散点图（如图3）：分别以参加比对两组数据的对数值（Ln）作为横纵坐标作图，以散点分布趋势直观判断两组数据的差异状况，沿45°对角线方向分布的基因，表示它在两样本中的表达量是相同的。距离对角线垂直距离越远的基因，表示它在某一样本中的差异表达程越大。设R=S/ C（S代表纵坐标上归一化后的样本数据，C代表横坐标上归一化后的样本数据），其中红色的点代表R≥2，即S相对C表达上调大于2倍的基因，绿色的点代表R≤0.5，即S相对C表达下调小于0.5倍的基因，蓝色的点表示0.5

1.4 基因表达谱分析结果：在所分析的21 073条人类功能基因中，加载组与未加载组人成骨细胞之间差异表达显著的基因有2 498条，其中表达上调的有899条(2.0倍以上),表达下降的有1 599条(0.5倍以下)。按其功能可分为：细胞信号和传递蛋白类基因；离子通道和运输蛋白；细胞周期相关基因；DNA结合蛋白、转录起始因子；代谢相关的酶和激酶基因；免疫球蛋白基因；细胞受体类基因；DNA合成、修复和重组蛋白类基因；细胞骨架蛋白；其它基因。

3讨论

应力作为细胞分子调控的一种刺激因子，是影响细胞结构和功能的重要的外界信息。骨组织为获得适应现存应力环境的理想结构，在人的一生中不断改建重塑。通过成骨细胞与破骨细胞对应力环境的感受，进行骨基质的有序合成和降解，从而维持骨组织的正常结构和功能。近10年来，虽然有关牵张应力条件下，体外成骨细胞生物学特性变化方面的研究很多，但牵张应力导致成骨细胞生物学行为变化的分子机制尚不清楚。由于生物体是一个复杂的网络，机械应力对成骨细胞功能的影响是通过多因子多通路的相互作用来控制的，传统的研究方式难以全面系统地了解成骨细胞对机械力刺激的反应模式。

基因表达谱芯片技术是集分子生物学、细胞遗传学、生物化学、计算机检测与分析等多种高新技术为一体的研究手段。其基本原理是通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库，收集cDNA 序列片段，分析其mRNA群体组成，从而实现对基因表达种类和丰度信息的描绘。基因表达谱从mRNA 水平反映了细胞或组织的特异性表型和表达模式。和其它的基因芯片相比，基因表达谱芯片的反应原理仍然是核酸杂交，所不同的是样品标记和检测系统。基因表达谱芯片通过双色荧光标记，将来源于不同细胞或组织的mRNA在逆转录反应中分别用不同颜色的荧光标记成探针，等量混合后与芯片上的基因进行杂交反应，用特有的荧光波长扫描结果芯片，并将扫描所得信号值输入计算机进行处理，给出每个点在不同波长下的荧光强度值及其比值(Ratio 值)，这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况。目前常用的荧光染料是Cy3(绿色)和Cy5(红色)。如果用Cy3 标记样本1 mRNA，Cy5 标记样本2 mRNA，反应后那些在样本2中呈高表达(或只在样本2中表达) 的基因其杂交点就会呈现红色，相反，那些在样本1中高表达(或只在样本1中表达) 的基因其杂交点就会呈现绿色, 在两样本中表达水平相当的显黄色, 而均不表达的则为无色[6-7]。本研究所选Agilent人1A基因表达谱芯片属于寡核苷酸芯片类型，共包括22 575个样点，其中覆盖人类基因21 073个，该基因芯片产品的寡核苷酸探针序列均来自国际公认的Incyte、RefSeq和GenBank数据库。

本研究通过对周期性牵张应力加载前后人成骨细胞内基因表达水平的监测，发现实验组相对于对照组上调2倍以上的基因有899种，按基因大致功能归属分，它们是7种细胞因子、113种酶、21种G蛋白偶联受体、8种生长因子、15种离子通道、25种激酶、4种依赖配体细胞核受体、16种肽酶、9种磷酸酶、76种转录调节基因、18种跨膜受体、45种运载体、其它的542种。实验组相对于对照组下调0.5倍以下的基因有1599种，它们是5种细胞因子、245种酶、8种G蛋白偶联受体、4种生长因子、6种离子通道、66种激酶、3种依赖配体细胞核受体、47种肽酶、28种磷酸酶、170种转录调节基因、7种跨膜受体、92种运载体、其它的918种。在这些发生变化的基因中，包括以往研究较多作用相对清楚的基因，如同源异形盒基因MSX1(Muscle segment homeobox gene)、转化生长因子-β、骨形成蛋白-2、表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）、胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor,IGF)、某些细胞外基质和相关蛋白及一些细胞粘附分子等基因[8-9]，但大部分参与成骨细胞应力反应的基因的作用和功能并不清楚。

由此可见，机械应力状态下人成骨细胞的应力反应调控过程是一个复杂的系统工程，本研究将为进一步研究机械应力状态下骨改建机理提供思路和线索。

[参考文献]

[1]Tang L,Zhu L,Li YM.Effects of Different Magnitudes Mechanical Strain on Osteoblasts in vitro[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,344:122-128.

[2]Liu J,Liu T,Zheng Y,et al.Early responses of osteoblast-like cells to different mechanical signals through various signaling pathways[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,348:1167-1173.

[3]唐 林，林 珠，李永明.不同大小机械牵张力对成骨细胞增殖及碱性磷酸酶的影响[J].解放军医学杂志，2006，6：580-581.

[4]唐 林，林 珠，李永明.机械牵张力对成骨细胞碱性磷酸酶及骨钙蛋白的影响[J].临床口腔医学杂志，2005，21（11）：648-650.

[5]唐 林，林 珠，李永明.不同大小机械牵张力对MC3T3-E1成骨样细胞MMP-13/TIMP-1 mRNA 表达的影响[J].中国美容医学，2006，15（4）：361-363.

[6]叶 芳，苑伟政.基于基因表达谱芯片的人参对衰老脑组织作用研究[J].西北工业大学学报，2006，24（5）：667-671.

[7]张占军，李 澎，刘慧兰，等.基因芯片技术在医药研究中的应用[J].中国药理学通报，2006，22(10)：1167-1171.

[8]Mackenzie A,Leeming GL,Jowett AK,et al. The homenbox gene Hox7. has specific regional and temporal expression patterns during early Murine craniofacial embryogenesis,especially tooth evelopment in vivo and vitro[J].Development,111:269-285.

[9]Panos GZ,Andrea-Paola RG,Tassos G,et al. The bone-specific transcriptional regulator cbfa1 Is a target of mechanical signals in osteoblastic cells[J].JBC,2002,277(26):23934-23941.

[收稿日期]2007-08-14 [修回日期]2007-09-18

编辑/何志斌

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