电针少阳经特定穴对偏头痛大鼠血清中NO、ET-1含量及50%PWT的影响

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〔摘要〕 目的 观察电针少阳经特定穴对于硝酸甘油（nitroglycerin，NTG）诱导的偏头痛（migraine，ME）大鼠模型血清中一氧化氮（NO）和内皮素（endothelin-1，ET-1）含量及50%缩足阈值（paw withdrawal threshold，PWT）的影响，比较电针少阳经特定穴和非经非穴在治疗ME大鼠的疗效差异。方法 健康SD大鼠40只，随机分为空白组（A组）、模型组（B组）、电针少阳经特定穴治疗组（C组）和电针非经非穴治疗组（D组），每组10只。B、C、D组按10 mg/kg臀部皮下注射NTG造模，A组臀部皮下注射等量生理盐水。造模后30 min，C组和D组分别行相应电针治疗30 min，测量各组大鼠不同阶段的50%PWT，采用硝酸还原酶法和ELISA分别检测大鼠血清中NO和ET-1含量。结果 造模后30 min：与造模前30 min比较，B、C、D组50%PWT显著降低（P<0.01）。治疗后30 min：与造模后30 min比较，C、D组的50%PWT显著升高（P<0.01）;與D组比较，C组50%PWT显著升高（P<0.01）。与A组比较，B组大鼠血清中的NO、ET-1的含量显著增高（P<0.01）;与B组比较：C组大鼠血清中的NO、ET-1含量显著降低（P<0.01），而D组大鼠血清中的NO、ET-1含量差异无统计学意义（P>0.05）;与D组比较，C组大鼠血清中的NO、ET-1含量显著降低（P<0.01）。结论 电针少阳经特定穴在治疗NTG诱导的ME大鼠模型中，能显著降低大鼠血清中NO、ET-1的含量，提高大鼠50%PWT，疗效明显优于电针非经非穴，该结果为临床应用电针少阳经特定穴治疗偏头痛提供一定的实验依据。

〔关键词〕 偏头痛;硝酸甘油;电针;少阳经特定穴;非经非穴;一氧化氮;内皮素

〔中图分类号〕R245;R747.2       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.023

偏头痛（migraine，ME）是临床常见的原发性头痛，其特征是发作性，多为偏侧、中重度、搏动样头痛，一般持续4～72 h，可伴有恶心、呕吐，光、声刺激或日常活动均可加重头痛，安静环境、休息可缓解头痛[1]，具有反复发作迁延难愈的特点，其发病机制迄今尚未清楚，可能与遗传、内分泌、血管因素、神经递质、免疫因素等有关。流行病学调查显示：偏头痛是人类第3位常见疾病[2]，为第6位致残性疾病[3]，影响全球成人人口的约14.7%[4]，并可导致缺血性中风、抑郁症、认知障碍和癫痫[5]，增加患者的家庭负担[6]。我国目前对于对ME患者的治疗仍然存在很大不足，主要体现在预防性治疗不充分，患者就诊率不高，以及镇痛药物过度使用[6-7]。目前ME的临床治疗尚未有根治的药物和方法，而针刺治疗ME的历史悠久，疗效确切，其有效性、简便性以及安全性已得到国内外广泛认同[8]，在临床上针刺少阳经穴的疗效显著[9]。本实验旨在前期研究的基础上，观察电针少阳经特定穴对硝酸甘油（nitroglycerin，NTG）诱导的ME大鼠血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）和内皮素-1（endothelin-1，ET-1）含量及50%缩足阈值（paw withdrawal threshold，PWT）的变化，比较电针少阳经特定穴和电针非经非穴的疗效差异，为临床治疗ME提供部分实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1  动物

健康SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量200～250 g，月龄3～4月，饲养温度20～25 ℃，湿度50%～70%，普通饲料喂养，自由饮水。动物合格证号：430047000382470、43004700035050，由湖南中医药大学动物实验中心提供，实验单位使用许可证编号：SCXK（2013-0005）。

1.2  主要试剂和仪器

硝酸甘油注射液（规格1 mL：5 mg，批准文号：国药准字H20057216，河南润弘制药有限公司）;华佗牌针灸针（规格0.25 mm×13 mm，生产批号：160230 ，苏州医疗用品有限公司）;华佗牌电子针疗仪（型号：SDZ-Ⅱ苏州医疗用品有限公司）;一氧化氮（NO）试剂盒（生产批号：20170819，武汉华美生物工程有限公司），内皮素（ET-1）试剂盒（生产批号：201708，武汉华美生物工程有限公司）;VonFre针刺痛觉测试套件（型号：Aesthesio）、37450-045大型多孔金属平台测试架（规格：90 cm×38 cm×40 cm底部网孔5 mm×5 mm）、多配置动物围栏（型号：37000-006）均来自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.3  模型制备与评价

1.3.1  实验性NTG型ME大鼠模型制作  参照宋丹宁等方法[10]按10 mg/kg臀部皮下注射硝酸甘油注射液造模。

1.3.2  行为学评价  造模约30 min后，大鼠出现双耳发红，前肢频繁搔头，爬笼次数增多、竖毛、活动增加等表现，持续约1～3 h，继而出现蜷卧、活动减少等状态，出现以上现象为造模成功。

1.3.3  50%缩足阈值评价  通过用纤维丝疼痛测试仪（von frey filament）[11]，记录引起大鼠四肢缩足反应显示的刺激力，推算50%PWT，以判断偏头痛大鼠的疼痛程度。每组大鼠造模前后对比，如果造模后的50%PWT较造模前降低，则说明大鼠造模后对疼痛敏感性增加，造模成功。

1.4  分组与处理

适应性喂养3 d，采用随机数字表法随机分为空白组（A组）、模型组（B组）、电针少阳经特定穴治疗组（C组）和电针非经非穴治疗组（D组）4组，每组10只。正常饲养7 d，第8天：A组：臀部皮下注射等容量生理盐水，30 min后捆绑束缚30 min;B、C、D组臀部皮下注射硝酸甘油造模，30 min后，B组捆绑束缚30 min，C组捆绑束缚后在少阳经特定穴上行电针治疗30 min;D组捆绑束缚后在非经非穴上行电针治疗30 min。各组在造模前30 min、造模后30 min、治疗后30 min分别测量其机械50%PWT。实验过程中对动物的各种处理均遵照“国际疼痛研究协会实验动物护理和使用指南”的有关规定。

1.5  穴位定位与针刺方法

1.5.1  少阳经特定穴风池  寰椎翼前缘直上方凹陷中，向鼻尖方向斜刺2～3 mm;外关：腕关节上3 mm，尺桡骨间，直刺1 mm;阳陵泉：距后三里上外侧5 mm左右，直刺6 mm（取穴定位：参照新世纪全国高等中医院校规划教材《实验针灸學》及华兴邦的大鼠穴位图谱[12]）。

1.5.2  非经非穴  林莺等[13]认为大鼠胁下确定一固定对照点作为非经非穴更有利于研究者进行操作研究，故非经非穴取大鼠胁下髂嵴上20～25 mm，后正中线旁开20 mm区段，双侧各取上下对称点，斜刺2 mm。

1.5.3  针刺方法  针刺时以华佗牌一次性使用针灸针（0.25 mm×13 mm），平补平泻手法，进针1～6 mm之间，捻转角度在180°，频率在120次/min左右;持续捻转0.5～2 min不等，行针结束后，电针少阳经特定穴组选一侧的外关和阳陵泉穴，而非经非穴组同侧两针，分别连接SDZ-Ⅱ型电子针疗仪导线的正负极，采用疏密波，10/50Hz，0.5～1.0 mA进行刺激，刺激强度以大鼠双上肢规律性抖动为准，30 min/次[14]。

1.6  检测指标及方法

1.6.1  血液样品的收集与处理  实验结束后，以20%乌拉坦4 mL/kg腹腔内注射麻醉，予腹主动脉采血，常温放置2～3 h后，予4 ℃ 3 000 r/min，离心15 min，取上清液，-20 ℃保存待测。分别采用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和硝酸还原酶法检测大鼠血清中ET-1和NO的含量。

1.6.2  50%PWT的测量  参照Chapland等的方法[15]，将大鼠置于穿孔金属平台上，以使后足底可以被实验者自由接触到，以标准动物围栏分笼隔开，并让大鼠适应环境15～30 min，等待大鼠的梳理和探究活动基本消失，使用纤维丝疼痛测试仪，刺激大鼠同侧后爪趾面的中间区域，观察其后肢缩足反射，记录引起大鼠缩足反应的刺激力及阳性阴性反应序列，通过up-down法（dixon法）[11]推算50%PWT。

1.7  统计学方法

采用SPSS 22.0统计学分析软件，全部计量资料用“x±s”表示，所有数据都进行正态性和方差齐性检验。满足正态性时，多组计量资料采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间比较若方差齐时采LSD检验，方差不齐时用Dunnett T3法检验;不满足正态性时选择秩和检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1  大鼠后肢的50%PWT比较

造模前30 min：各组间50%PWT差异无统计学意义（P>0.05），提示具有齐同可比性。造模后30 min：与造模前30 min比较，B、C、D组50%PWT显著降低（P<0.01），说明造模对大鼠50%PWT有明显影响，可提高大鼠疼痛敏感性，提示造模成功。治疗后30 min：与造模后30 min比较，B组平均50%PWT增加，但差异无统计学意义（P>0.05），提示大鼠对于疼痛可能有一定自愈性;C、D组的50%PWT显著升高（P<0.01），提示电针少阳经特定穴和非经非穴能降低大鼠疼痛敏感性，具有镇痛效果;与D组比较，C组50%PWT显著升高（P<0.01），说明电针少阳经特定穴镇痛效果明显优于电针非经非穴。详见表1。

2.2  血清中NO、ET-1比较

与A组比较，B组大鼠血清中的NO、ET-1的含量显著增高（P<0.01），提示造模成功。与B组比较：C组血清中的NO、ET-1含量显著降低（P<0.05，P<0.01），说明电针少阳经特定穴能够降低血清内NO、ET-1的含量;而D组血清中的NO、ET-1含量差异无统计学意义（P>0.05），说明电针非经非穴对于血清内NO、ET-1的含量无明显影响。与D组比较，C组大鼠血清中的NO、ET-1含量显著降低（P<0.01），说明电针少阳经特定穴较电针非经非穴能够有效降低血清内NO、ET-1的含量。详见表2。

3 讨论

中医学认为ME多累计在眼眶、额、颞等手足少阳经循行部位，根据经络理论中的依部辩经，ME病属少阳经，由“经脉所过，主治所及”，故针刺治疗ME应以少阳经穴为主[16-18]。本实验所选三穴均为少阳经特定穴，分析如下：风池穴属足少阳胆经，为手足少阳与阳维之会，针刺风池具有祛风解表、通达脑目、宣通经气、调和气血之功;外关是手少阳三焦经络穴，八脉交会穴之一，通于阳维脉，针刺外关可疏风散邪、发表解热，有较强的理气活血止痛之功;阳陵泉为足少阳胆经合穴，因“合治内腑”，且为筋会，位居下肢，远离病所，故针刺阳陵泉乃上病下取，有舒筋通络、行气止痛、疏肝理气、利胆和胃的功效。该三穴遵循上下配穴和左右配穴的治疗原则，充分发挥了腧穴的近治和远治作用，具有祛风清热、舒筋通络、和解少阳的作用，使得气血通畅，疼痛缓解。

ME发病机制迄今尚不完全清楚，三叉神经血管反射学说[19]是目前研究ME发病机制的主流学说，主要涉及3种机制：供应脑膜的颅内脑外血管扩张、血管周围神经释放血管活性肽引起神经源性炎症以及中枢痛觉传导的抑制降低[20]。在正常人体中，ET-1和NO处于一种动态平衡状态，共同维持血管的张力正常，但在ME的发作期，具有收缩血管功能的 ET 释放量增加，使NO代偿性升高，二者的失衡是ME的重要致病因素之一[8]。NO在ME的发生中起重要作用，为引发ME患者机体级联反应的始动因子，是一种血管内皮细胞舒张因子， 通过激活平滑肌细胞内游离的鸟苷酸环化酶（guanylate cyclase， GC），提高CGMP水平，CGMP作为第二信使和神经递质激活三叉神经节，使局部神经肽-降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide，CGRP）反复释放，在松弛血管平滑肌、舒张血管、增加血流量的同时还引发NI;NO还可直接影响血管旁感觉神经，脑神经元对一氧化氮毒性反应极脆弱，从而直接激活感觉神经纤维，提高伤害感觉神经元的敏感性，介导机体内痛觉信號的传导，从而放大其生物学作用，致使痛觉的发生[21]。内皮素（ET-1）是血管内皮细胞分泌的一种由21个氨基酸组成的血管收缩肽，是迄今发现的最强的缩血管物质，参与ME发作时的血管收缩[22]，而脑血管是ET-1最为敏感的效应器之一[23]。生理状态下ET-1的合成释放极低，ET-1通过血管平滑肌细胞膜上的受体与靶细胞膜结合，激活GC、磷酸肌醇系统和Ca2+通道，提高细胞质中Ca2+浓度而影响血管张力，触发ME[20]。内皮素还可激活炎性因子等，使血管通透性增加，血清蛋白渗出，形成无菌性炎症，调节疼痛感受器，从而参与ME的发生[24]。宋玉强等[25]人认为ME患者血浆NO和ET-1的动态比例失衡 ，影响血管的舒缩功能，在ME的发病机制中起重要作用。陈白云[26]的动物研究发现针刺可使ME大鼠模型眼眶静脉血清中ET-1和NO的含量降低。

本次实验中选择非经非穴组作为安慰对照组，以NTG诱导的ME大鼠为受试对象，从血清中NO和ET-1含量及50%PWT的变化对比为中心，比较电针少阳经特定穴和电针非经非穴治疗ME大鼠的疗效差异。实验中造模前取30 min内这个时间段是因为行为学、50%PWT测定都需要一定的时间以30 min为一个时间段便于统计，造模后30 min内是因为在前期预实验中我们发现0～30 min这个时间段大鼠行为学最活跃，50%PWT改变最明显，治疗后30 min内是因为本次实验电针治疗偏头痛是取针刺的即刻镇痛效应，治疗后马上测量50%PWT。实验结果显示：在50%PWT比较中，治疗后30 minC、D组50%PWT较造模后30 min显著升高（P<0.01），提示电针少阳经特定穴和非经非穴能降低大鼠疼痛敏感性，具有镇痛效果，而与D组比较，C组50%PWT更高，差异具有统计学意义（P<0.01），说明电针少阳经特定穴镇痛效果优于电针非经非穴;在血清NO和ET-1的比较中，与B组比较，D组NO、ET-1的含量差异无统计学意义（P>0.05），C组NO、ET-1的含量显著降低（P<0.05，P<0.01），说明电针少阳经特定穴可降低血清中NO、ET-1含量，而电针非经非穴对于NO、ET-1的影响不明显;与D组比较，C组NO、ET-1含量更低，差异具有统计学意义（P<0.01），说明电针少阳经特定穴可降低大鼠血清中NO、ET-1含量，明显优于电针非经非穴。综上所述，电针少阳经特定穴能够显著降低NTG诱导的ME大鼠血清中NO、ET-1的含量，跟以往实验结果相同，提高50%PWT，降低大鼠对于疼痛的敏感性，对疼痛更为耐受，疗效优于电针非经非穴，这为临床应用电针少阳经特定穴治疗偏头痛提供一定的实验依据。

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