牛蒡子苷元对ConA诱导小鼠急性肝炎的保护作用

[摘要] 目的 研究牛蒡子苷元（ATG）对刀豆蛋白A（ConA）诱导的小鼠急性肝炎的保护作用。方法 将C57BL/6小鼠随机分成DMSO组、ConA/DMSO组、ConA/ATG组，每组10只小鼠。DMSO组和ConA/DMSO组小鼠腹腔注射DMSO，ConA/ATG组小鼠腹腔注射等体积ATG（30 mg/kg），5 h后ConA/DMSO组和ConA/ATG组尾静脉注射ConA（20 mg/kg）。12 h后处死小鼠，取血清和肝脏组织，用生化分析仪测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，苏木精-伊红（HE）染色检测肝组织病理损伤，TUNEL染色检测肝细胞凋亡，ELISA方法检测血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）水平，q-PCR方法检测肝组织中TNF-α和IFN-γ mRNA表达水平，流式细胞术检测骨髓来源抑制细胞（MDSCs），生化法检测肝脏匀浆丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）的表达水平。结果 与DMSO组相比，ConA/DMSO组血清ALT和AST水平明显升高（F=125.80、94.74，P<0.05）；肝脏组织损伤明显加重；肝细胞凋亡增加；血清和肝组织中TNF-α和IFN-γ水平升高（F=17.52、68.81，P<0.05）；肝脏MDSCs募集活化降低；同时MDA和MPO活性升高（F=13.38、14.78，P<0.05）。与ConA/DMSO组比较，ConA/ATG组血清ALT和AST水平明显降低（F=125.80、94.74，P<0.05）；肝脏组织损伤明显减轻；肝细胞凋亡减少；血清中TNF-α和IFN-γ的水平降低（F=17.52、68.81，P<0.05）；肝组织中TNF-α和IFN-γ mRNA的表达水平降低（F=31.55、14.64，P<0.05），MDSCs募集活化明显增强；MDA和MPO活性降低（F=13.38、14.78，P<0.05）。结论 ATG对ConA诱导的小鼠急性肝炎具有明显的保护作用。

[关键词] 牛蒡子苷元；肝炎；刀豆蛋白A；肿瘤坏死因子α；干扰素γ

[中图分类号] R575.1

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2018）03-0268-05

研究结果表明，自身免疫性肝炎和病毒性肝炎是人类主要的肝脏疾病，具有较高的发病率和死亡率，是严重危害人类健康的疾病[1-3]。急性肝炎的病因通常包括病毒感染、过度饮酒、自身免疫缺陷和药物，免疫因素引起的肝脏损伤在肝炎发病过程中具有重要的作用。1992年TIEGS等[4]研究结果显示，小鼠静脉给予刀豆蛋白A（ConA）后，血清转氨酶升高，肝脏出现大面积损伤并伴有炎性细胞浸润等现象，用免疫抑制剂处理后肝脏损伤减轻。ConA诱导的小鼠急性肝炎发病机制及其病理过程与人类肝炎极其相似，因此该模型已被广泛应用于肝病研究中，对药物的筛选及研发均具有重要的作用[5]。牛蒡子苷元（ATG）是一种木脂素成分，主要存在于菊科属植物如牛蒡子、瓜蒌牛蒡、水母雪莲和日本榧树等中[6]。ATG在牛蒡子中含量较高，是牛蒡子的活性成分，具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗结肠炎、免疫抑制和神经保护等作用[7-10]。目前ATG对急性肝炎的保护作用机制尚不十分明确。本文研究以ConA诱导的C57BL/6小鼠急性肝炎为模型，研究ATG对急性肝炎的保护作用并初步探讨其机制。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 藥物和试剂

ATG（天津百倍生物公司）；ConA（Sigma公司，美国）；血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）ELISA试剂盒（BioLegend公司，美国）；TRIzol及反转录试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）；SYBR Green MasterMix（南京诺唯赞生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）试剂盒（南京建成生物研究所）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物及模型建立 雄性、6～8周C57BL/6小鼠30只，购自济南朋悦实验动物有限公司，饲养于SPF级动物房中。随机分成3组：DMSO组（A组）、ConA/DMSO组（B组）、ConA/ATG组（C组），各10只小鼠。ConA/ATG组和ConA/DMSO组小鼠分别给予腹腔注射ATG（30 mg/kg）和等量的DMSO，5 h后两组小鼠均经尾静脉注射ConA（20 mg/kg），DMSO组小鼠腹腔注射DMSO。12 h后处死各组小鼠，分别收集眼球静脉血和肝脏组织。

1.2.2 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测 小鼠血清送济宁市第一人民医院用自动生化分析仪检测ALT和AST。

1.2.3 肝组织染色和TUNEL染色观察 取同一部位肝脏固定于40 g/L多聚甲醛中，石蜡包埋、切片，厚度为5 μm。经脱蜡和水化，行苏木精-伊红（HE）和TUNEL染色，观察肝脏组织损伤程度和肝细胞凋亡情况。

1.2.4 血清TNF-α以及IFN-γ水平的测定 应用ELISA方法，根据试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 肝组织TNF-α和IFN-γ mRNA表达检测

①肝组织RNA提取：取小鼠适量肝组织，以TRIzol法提取RNA，最后根据沉淀的量加入适量DEPC水溶解。上机检测浓度并反转录，置于-80 ℃保存待用。②q-PCR检测：TNF-α和IFN-γ引物均购自上海生工生物工程公司，以GAPDH为内参对照。引物序列见表1。按照试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，采用SYBR Green荧光标记进行q-PCR检测，反应条件根据说明书设定，结果以2-△△Ct法进行计算。

1.2.6 流式细胞术检测肝脏骨髓源性抑制性细胞（MDSCs） 提取肝脏单核细胞，制备单细胞悬液，加入FITC标记CD11b抗体和APC标记Gr-1抗体，室温孵育30 min，PBS清洗，离心（1 500 r/min，5 min），去上清，加入300 μL的PBS重悬细胞，上机检测。

1.2.7 肝脏MDA和MPO测定 取小鼠肝脏组织于生理盐水中清洗，按照试剂盒说明书制备50 g/L和10 g/L匀浆，检测MDA和MPO活性。

1.3 统计学方法

应用GraphPad Prism5软件进行统计学分析，计量资料结果以[AKx-D]±s形式表示，多组数据间比较采用F检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肝功能比较

与DMSO组相比，ConA/DMSO组小鼠血清中ALT和AST明显升高；与ConA/DMSO组相比，ConA/ATG组血清ALT和AST明显升高，差异均有显著性（F=125.80、94.74，P<0.05）。见表1。HE染色显示，与DMSO组相比，ConA/DMSO组肝组织中出现大片损伤；与ConA/DMSO组相比，ConA/ATG组肝损伤面积明显减少。

2.2 各组肝细胞凋亡情况比较

TUNEL染色结果显示，与DMSO组小鼠相比较，ConA/DMSO组小鼠出现大量肝细胞凋亡；与ConA/DMSO组比较，ConA/ATG组肝脏细胞凋亡数目明显减少。见图1。

2.3 各组血清TNF-α和 IFN-γ水平比较

ELISA检测结果显示，与DMSO组小鼠相比较，ConA/DMSO组血清中TNF-α和IFN-γ浓度明显升高；与ConA/DMSO组相比较，ConA/ATG组血清中TNF-α和IFN-γ浓度明显降低，差异有显著性（F=17.52、68.81，P<0.05）。见表2。

2.4 各组肝脏组织TNF-α和 IFN-γ mRNA表达比较

q-PCR检测结果显示，与DMSO组小鼠相比较，ConA/DMSO组肝脏组织TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平较明显升高；与ConA/DMSO组相比，ConA/ATG组小鼠肝脏组织TNF-α和IFN-γ mRNA表达明显降低，差异有显著意义（F=31.55、14.64，P<0.05）。见表2。

2.5 各组肝脏MDSCs比较

流式细胞术检测结果显示，与DMSO组比较，ConA/DMSO组小鼠肝脏MDSCs募集活化减少；而与ConA/DMSO组相比较，ConA/ATG组小鼠肝脏中的MDSCs的比例明显增加（图2）。

2.6 各组肝组织中MDA和MPO比较

与DMSO组相比较，ConA/DMSO组MDA和MPO水平均上升；与ConA/DMSO组比较，ConA/ATG组MDA和MPO水平下降，差异有统计学意义（F=13.38、14.78，P<0.05）。见表3。

3 讨论

近年来中草药治疗肝脏疾病越来越广泛地引起人们的关注[11]，ATG就是其中具有治疗潜力的一种。ATG是牛蒡子的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤等多种药理活性[7-10]。有研究表明，牛蒡子对四氯化碳和乙醇诱导的肝炎具有保护作用[12]，但是ATG对ConA诱导的急性肝炎的保护作用及机制还不明确。

ConA是T细胞的特异性有丝分裂原，在肝脏内能迅速募集活化T细胞、NK细胞和NKT细胞，并分泌大量的炎性因子如TNF-α和IFN-γ等，在ConA诱导肝损伤的发病过程中有重要作用[5，13-15]。TNF-α是介導肝炎发生的终末递质，与其受体结合进而诱发凋亡级联反应，也可激活中性粒细胞并促进其发生趋化作用进而聚集肝脏中，通过释放蛋白酶和氧自由基促进肝细胞发生凋亡或坏死[16]。有研究发现，细胞凋亡在ConA诱导的急性肝炎发病过程中发挥重要作用，用抑制剂阻断凋亡通路时，ConA诱导的急性肝炎明显减轻[17]。另外，IFN-γ通过协同TNF-α促进各种趋化因子和黏附分子的释放发挥其病理作用[18-19]。研究显示，用抗TNF-α和抗IFN-γ抗体预处理的小鼠或TNF-α和IFN-γ受体缺陷的小鼠均对ConA诱导的肝损伤具有抵抗作用[18-19]。本文研究结果显示，ConA/ATG组小鼠血清和肝脏中TNF-α和IFN-γ水平均较ConA/DMSO组显著下降，而且肝细胞凋亡明显减轻，提示ATG可抑制炎性因子的表达与释放，同时抑制细胞凋亡对肝脏产生保护作用。

MDSCs是一种免疫异质细胞，包括未成熟树突状细胞（DCs）、巨噬细胞和其他髓系细胞。人类MDSCs在早期分化阶段通常表达CD11b、CD33，低表达白细胞抗原DR，小鼠MDSCs通常表达CD11b和Gr-1[20-21]。肝脏血流丰富，含有大量的先天和适应性免疫细胞亚型。有研究发现，MDSCs在诱导肝脏免疫抑制方面发挥重要的作用，小鼠皮下接种肿瘤后大量的MDSCs流入肝脏[22]。还有研究结果显示，MDSCs对ConA诱导的急性肝炎具有免疫抑制作用[23]。本文的结果显示，与ConA/DMSO组比较，ATG预处理组肝脏中MDSCs细胞明显升高，提示ATG通过募集活化MDSCs对ConA诱导的急性肝炎具有保护作用。

氧自由基是生物氧化还原反应过程中的重要代谢产物，一般情况下，其产生和消除需要达到一定的平衡状态，机体才能维持正常水平。氧化应激的特点是脂质过氧化增加或改变非酶和酶的抗氧化系统。MDA是膜磷脂发生过氧化反应的重要产物，可破坏细胞膜的完整性，检测其含量可以间接反映细胞膜系统损伤严重程度。MPO是一种内源性溶酶体酶，主要存在于中性粒细胞中，可以清除H2O2并促进具有毒性作用的次氯酸形成[25]。因此，检测脂质过氧化产物MDA和MPO含量可以了解肝脏损伤情况。本文实验结果表明，ConA/ATG组小鼠MDA和MPO活性较ConA/DMSO组均降低，差异有显著性，说明ATG可通过降低MDA和MPO的活性对肝脏发挥保护。

综上所述，ATG可通过抑制炎性细胞因子的表达及细胞凋亡、促进MDSCs在肝脏募集、改善细胞氧化应激反应，从而对ConA诱导的小鼠急性肝炎发挥保护作用。但ATG保护作用的具体分子机制还有待于进一步研究。

[參考文献]

[1]LONGHI M S， MIELI-VERGANI G， VERGANI D. Autoimmune hepatitis[J]. Current Pediatric Reviews， 2014，10（4）：268-274.

[2]REHERMANN B， NASCIMBENI M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection[J]. Nature Reviews Immunology， 2005，5（3）：215-229.

[3]THIMME R， WIELAND S， STEIGER C， et al. CD8（+） T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection[J]. Journal of Virology， 2003，77（1）：68-76.

[4]TIEGS G， HENTSCHEL J， WENDEL A. A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A[J]. The Journal of Clinical Investigation， 1992，90（1）：196-203.

[5]BONDER C S， AJUEBOR M N， ZBYTNUIK L D， et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis[J]. Journal of Immunology （Bal-timore， Md.：1950）， 2004，172（1）：45-53.

[6]BASTOS J K， CARVALHO J C， DE SOUZA G H， et al. Anti-inflammatory activity of cubebin， a lignan from the leaves of Zanthoxyllum naranjillo Griseb[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2001，75（2/3）：279-282.

[7]CHO M K， JANG Y P， KIM Y C， et al. Arctigenin， a phenylpropanoid dibenzylbutyrolactone lignan， inhibits MAP kinases and AP-1 activation via potent MKK inhibition： the role in TNF-alpha inhibition[J]. International Immunopharmacology， 2004，4（10/11）：1419-1429.

[8]AWALE S， LU J， KALAUNI S K， et al. Identification of arctigenin as an antitumor agent having the ability to eliminate the tolerance of cancer cells to nutrient starvation[J]. Cancer Research， 2006，66（3）：1751-1757.

[9]ZHU Z Y， YAN J M， JIANG W， et al. Arctigenin effectively ameliorates memory impairment in Alzheimer’s disease model mice targeting both β-amyloid production and clearance[J]. The Journal of Neuroscience， 2013，33（32）：13138-13149.

[10]WU X， DOU Y N， YANG Y， et al. Arctigenin exerts anti-colitis efficacy through inhibiting the differentiation of Th1 and Th17 cells via an mTORC1-dependent pathway[J]. Biochemical Pharmacology， 2015，96（4）：323-336.

[11]TAMARU M， NISHIOJI K， KOBAYASHI Y， et al. Liver-infiltrating T lymphocytes are attracted selectively by IFN-inducible protein-10[J]. Cytokine， 2000，12（4）：299-308.

[12]LIN S C， LIN C H， LIN C C， et al. Hepatoprotective effects of Arctium lappa Linne on liver injuries induced by chronic ethanol consumption and potentiated by Carbon tetrachloride[J]. Journal of Biomedical Science， 2002，9（5）：401-409.

[13]ISHIZAKI K， IWAKI T， KINOSHITA S， et al. Ursodeoxycholic acid protects concanavalin A-induced mouse liver injury through inhibition of intrahepatic tumor necrosis factor-alpha and macrophage inflammatory protein-2 production[J]. European Journal of Pharmacology， 2008，578（1）：57-64.

[14]WOLF A M， WOLF D， RUMPOLD H， et al. The kinase inhibitor imatinib mesylate inhibits TNF-[alpha] production in vitro and prevents TNF-dependent acute hepatic inflammation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2005，102（38）：13622-13627.

[15]SCHMANN J， WOLF D， PAHL A， et al. Importance of kupffer cells for t-cell-dependent liver injury in mice[J]. The American Journal of Pathology， 2000，157（5）：1671-1683.

[16]GANTNER F， LEIST M， LOHSE A W， et al. Concanavalin A-induced T-cell-mediated hepatic injury in mice： the role of tumor necrosis factor[J]. Hepatology （Baltimore， Md.）， 1995，21（1）：190-198.

[17]FILLIOL A， PIQUET-PELLORCE C， LE SEYEC J， et al. RIPK1 protects from TNF-α- mediated liver damage during hepatitis[J]. Cell Death & Disease， 2016，7（11）： e2462.

[18]KUSTERS S， GANTNER F， KUNSTLE G， et al. Interferon gamma plays a critical role in T cell-dependent liver injury in mice initiated by concanavalin A[J]. Gastroenterology， 1996，111（2）：462-471.

[19]MIZUHARA H， UNO M， SEKI N， et al. Critical involvement of interferon gamma in the pathogenesis of T-cell activation-associated hepatitis and regulatory mechanisms of interleukin-6 for the manifestations of hepatitis[J]. Hepatology （Baltimore， Md.）， 1996，23（6）：1608-1615.

[20]TALMADGE J E， GABRILOVICH D I. History of myeloid-derived suppressor cells[J]. Nature Reviews Cancer， 2013，13（10）：739-752.

[21]GABRILOVICH D I， BRONTE V， CHEN S H， et al. The terminology issue for myeloid- derived suppressor cells[J]. Cancer Research， 2007，67（1）：425-428.

[22]ILKOVITCH D， LOPEZ D M. The liver is a site for tumor-induced myeloid-derived suppressor cell accumulation and immunosuppression[J]. Cancer Research， 2009，69（13）：5514-5521.

[23]ZHANG H R， LI Z， WANG L， et al. Critical role of myeloid-derived suppressor cells in tumor-induced liver immune suppression through inhibition of NKT cell function[J]. Frontiers in Immunology， 2017，8（8）：129-135.

[24]LIU C M， SUN Y Z， SUN J M， et al. Protective role of quercetin against lead- induced inflammatory response in rat kidney through the ROS-mediated MAPKs and NF-κB pathway[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2012，1820（10）：1693-1703.

[25]SAWAYAMA Y， MIYAZAKI Y， ANDO K， et al. Expression of myeloperoxidase enhances the chemosensitivity of leukemia cells through the generation of reactive oxygen species and the nitration of protein[J]. Leukemia， 2008，22（5）：956-964.

推荐访问： 牛蒡 小鼠 肝炎 诱导 作用

---