p73基因在急性白血病中的表达及临床意义

[摘要] 目的 探讨p73基因在急性白血病(AL)中的表达及其临床意义。方法 采用RT-PCR方法检测100例初诊及复发或难治AL患者和20例正常对照者p73基因的表达,并采用χ2检验、t检验及单因素方差分析对结果进行统计学分析,以比较各组p73基因表达阳性率及表达强度差异。结果 58%的AL患者有较高水平的p73的表达,初诊及复发或难治组明显高于经过治疗缓解组及正常对照组(P<0.05)。结论 p73基因表达在AL的发病机制及不良预后中起了重要的作用。

[关键词] 急性白血病; p73; 发病机制; 预后

[中图分类号] R733.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)09-01-03

Expression of p73 Gene in Acute Leukemia and Its Clinical Significance

LI Qiau1# SU Liping2 WU Jiaui3 ZHAO Jin2 SHI Lei4 LI Mingli1 ZHENG Meijing1 DUAN Jingjing1 ZHOU Yongan5*

1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030000,China;2.Shanxi Province Tumor Hospital,Taiyuan 030000,China;3.Shanxi Province Children"s Hospital,Taiyuan 030000,China;4.The Second Hospital of Shanxi Medcical University,Taiyuan 030000,China;5.Taiyuan Central Hospital,Taiyuan 030000,China

[Abstract] ObjectiveTo study the p73 gene expression in acute leukemia(AL) and its clinical significance. MethodsThe p73 gene ex- pression in 100 cases of AL including newly diagnosed and recrudescent or refractory ones and 20 normal controls was detected by relative quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR),and then the results were analyzed and compared by χ2-test,t-test and single agent variance. ResultsThe higher expression of p73 gene was found in 58% of AL cases. The expression level of p73 gene in newly diagnosed and recrudescent or refractory cases was significantly higher than that of the relief cases after therapy and than that of the controls(P<0.05). ConclusionThe expression of p73 gene plays an important role in the pathogenesis and poor prognosis of AL.

[Key words]Acute leukemia; P73; Pathogenesis; Prognosis

p73基因是1997年由法国的Kaghad等[1]从神经母细胞瘤细胞系中克隆出来的具有抑癌作用的基因。p73基因是p53基因家族的新成员,具有细胞周期调节及诱导细胞凋亡的作用,但是与p53基因在人类肿瘤发生中经常发生突变不同,至今极少发现p73有突变,而且p73基因在不同肿瘤中表达水平差异很大,显示了抑癌基因和癌基因的双重特性[2]。我们采用RT-PCR方法检测了AL患者骨髓单个核细胞p73 mRNA的表达,并分析了p73 mRNA表达与诱导缓解化疗的疗效及复发的关系,探讨p73基因与AL的发生、发展及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2008年6月～2009年3月期间在山西医科大学第二医院及山西省肿瘤医院血液科住院的初治及复发或难治急性白血病患者100例,经临床及骨髓涂片细胞形态学、细胞化学检查,按张之南主编《血液病诊断及疗效标准》[3]确诊。包括初发未治64例,复发或难治36例,按FAB分型,急性非淋巴细胞白血病(ANLL)80例(M2 12例,M3 35例,M4 18例,M5 9例,M6 6例),急性淋巴细胞白血病(ALL)20例。其中男60例,女40例,中位年龄40岁(9~65岁)。对照组为20例非白血病(NL)且骨髓象正常者。

1.2 治疗方法

采用ANLL用MA(米托蒽醌、阿糖胞苷)或DA(柔红霉素、阿糖胞苷)方案。ALL用VDLD(长春新碱、柔红霉素、门冬酰胺酶、地塞米松)方案治疗。初治及复发或难治急性白血病患者采集骨髓液2mL(幼稚细胞大于50%),对照组采集外周血2mL,肝素抗凝,分离单个核细胞,-80℃冰箱保存备用。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA的提取与鉴定 用Trizol提取液提取细胞总RNA,溶于20μLDEPC水中,并鉴定其纯度及完整性,-80℃保存备用。

1.3.2 引物 p73上游引物:5"-AGCGGAATTCACCACCATCCT-3",下游引物:5"-CCAGGCTCTTTCAGCTTCA-3",扩增产物长度为390bp;β-actin上游引物:5"-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3",下游引物:5"-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3",扩增产物长度为240bp。

1.3.3 cDNA合成 20μL反应体系,包括总RNA 2μL,随机引物1μL,逆转录酶AMV 2U,10mmol/L dNTP 2μL,1.25U/μL RNAi 1μL。反应条件:42℃ 60min,94℃ 5min。

1.3.4 PCR扩增 p73、β-actin的cDNA上述逆转录产物5μL,总反应体系20μL。终浓度MgCl2 21.5mM,dNTPs0.2mM,上下游引物各0.4pM,Taq酶1U,逆转录产物5μL。反应条件:95℃ 3min;94℃ 40s,55℃ 50s,72 ℃ 60s,35个循环;72℃ 10min。

1.3.5 电泳及扫描分析 取2%琼脂糖凝胶,电泳上述PCR产物20min,在凝胶成像系统下拍照,并测定p73和β-actin扩增产物电泳带强度的积分值,记录每例p73/β-actin。采用SPSS13.0软件进行统计,分别采用χ2检验、t检验及单因素方差分析对p73 mRNA在AL细胞及不同细胞类型中表达的阳性率及强度结果进行分析。

2 结果

2.1 p73基因蛋白在AL细胞及不同细胞类型中表达的阳性率及强度比较

见表1、图1。

2.2 NL组与AL患者组p73 mRNA表达的比较

患者组p73 mRNA表达率为49.0%,高于对照组20.0%,两组表达率差异有统计学意义(χ2=5.68>χ20.05,1=3.84,P<0.05);两组p73 mRNA表达强度差异有统计学意义(χ2=4.13>χ20.05,1= 3.84,P<0.05)。

2.3 ALL组与ANLL组p73 mRNA表达的比较

p73 mRNA在ANLL细胞表达阳性率56.3%,高于ALL细胞表达阳性率20.0%,两组差异有统计学意义(χ2=8.41>χ20.005,1=7.88,P<0.005);两组p73 mRNA表达强度亦有统计学意义(χ2=4.25>χ20.05,1=3.84,P<0.05)。

2.4 ANLL组各型之间p73 mRNA表达的比较

ANLL组按FAB分型分为M2、M3、M4、M5及M6型,无M0、M1及M7型,p73 mRNA在各型表达率分别为50.0%、51.4%、55.6%、77.8%、66.7%,采用单因素方差分析比较各组阳性率,差异有统计学意义(P<0.05);各组p73 mRNA表达强度差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 一般预后组与不良预后组p73 mRNA表达的比较

对接受治疗的84例患者随访半年以上。根据对化疗的反应及复发情况分为两组:(1)一般预后组:患者经诱导治疗达完全缓解(CR)或部分缓解(PR),均持续半年以上。共56例,其中ALL16例,ANLL40例。p73 mRNA表达率分别为75.0%(12/16)及25.0%(10/40)。(2)不良预后组:患者治疗失败或复发共28例,其中ALL4例,ANLL24例。p73 mRNA表达率分别为25.0%(1/4)及79.2%(19/24)。采用单因素方差分析分别比较ALL及ANLL患者一般预后组与不良预后组p73 mRNA表达率的差异均具有统计学意义(P<0.05);两组p73 mRNA表达强度比较,差异也有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

p73基因在AL发病、不良预后及治疗中的意义:p73基因与经典的抑瘤基因p53高度同源,p73基因的过表达可诱导肿瘤细胞的生长阻滞并诱导其调亡。约1/3的急性淋巴细胞白血病和Burkitt淋巴瘤病人的p73基因表达缺失,但急性髓系白血病病人的p73表达水平高于正常白细胞。Corn等[4]、Kawanos[5]等研究表明,p73基因低水平或失表达在ALL的形成中起促进作用。p73基因的失表达在ALL中是高频率发生事件,p73基因在ALL形成中起着抑癌基因作用。

本实验资料检测的ALL组p73 mRNA存在较高比例的阴性表达,达80%(16/20),与Liu[6]等研究结果相似,提示p73基因的失活在小儿ALL的发生、发展中起重要作用。亦表明在ALL中p73基因起着抑癌基因样作用,这与已有研究结果相似。ANLL组p73 mRNA的表达初诊患者阳性率达56.3%,明显高于ALL组20.0%;而通过治疗后的研究发现,预后良好组p73 mRNA的表达明显低于预后不良组,这表明在急性髓系白血病中p73基因可能不会出现高甲基化而表达缺失,反而表现为癌基因样作用。

有研究表明,癌相关基因(包括p73基因)启动子高甲基化是ALL的独立预后因子[7],高甲基化抑制基因转录可能是高甲基化改变了基因构型,影响DNA特异序列与转录因子结合,使基因不能转录,因此p73基因可能是AL中一个新的生物学预后因子。Kawano等[5]及Bell等[8]通过相关研究,提示临床可以通过检测ALLp73基因失活与高甲基化程度,利用52AC等去甲基化制剂调节p73基因的表达,相信直接或有选择地激活p73可用来治疗恶性肿瘤。

我们通过研究证实了过度表达及失表达与AL的发病及不良预后的密切相关性,ALL组与ANLL组患者初诊时及治疗后p73基因的表达情况不同,ALL组初诊时表达阳性率(20.0%)较低,治疗后一般预后组p73基因的表达阳性率(75.0%)明显增高;而ANLL组初诊时表达阳性率(56.3%)较高,治疗后预后良好组p73基因的表达阳性率(25.0%)降低,这表明p73基因在不同类型白血病中表现的作用不同,可表现为抑癌基因或癌基因作用,但本实验样本资料较少,还需要进一步研究证实。35岁以下成人的恶性肿瘤中白血病所致死亡率居第1位。尽管通过化学治疗或骨髓移植可达CR,但仍存在感染、出血等危及生命的并发症、复发及耐药等问题。相信通过不断地研究,临床上即可通过检测和分析p73基因,为AL的预后判断提供有价值的信息,也可为个体化、分子水平的治疗——去甲基化治疗及基因治疗提供依据,从而为AL提供一种新的治疗模式。

[参考文献]

[1] Kaghad M,Bonnet H,Yang A,et al. Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36,a region f requently deleted in neuroblastoma and other human cancer[J]. Cell,1997,90(22):809-819.

[2] 何勇,童玲,范士志,等. p73基因与人类肿瘤的研究进展[J]. 肿瘤防治杂志,2005,12(7):551-554.

[3] 张之南. 血液病诊断及疗效标准[M]. 第3版. 北京:科学出版社,1998:214-218.

[4] Corn PG,Kuerbiitz SJ,Van Noesel MM,et al. Transcriptional silencing of the p73 gene in acute lymphoblastic leukemia and Burkitt′s lymphoma is associated wit h 5′CpG island met hylation[J].Cancer Res,1999,59(14):3355.

[5] Kawano S,Miller CW,Gombart AF,et al. Loss of p73 gene expression in leuke mias/lymphomas due to hypermethylation[J]. Blood,1999,94(3):1113-1120.

[6] Liu M,Taketani T,Li R,et al. Loss of p73 gene expression in lymphoid leukemia cell lines is associated with hypermethylation[J]. Leuk Res,2001, 25(6):443.

[7] Roman Gomez J,Velasco A,Castillejo JA,et al. Promoter hypermethylation of cancer-related genes:a strong independent prognostic factor in acute lymphoblastic leukemia[J]. Blood,2004,104(8):2492-2498.

[8] Bell HS,Dufes C,O′Prey J,et al. A p53-derived apoptotic peptide derepresses p73 to cause tumor regression in vivo[J]. J Clin Invest,2007, 117(4):1008-1018.

(收稿日期:2009-11-23)

推荐访问： 白血 基因 病中 表达 临床意义

---