医疗器械灭菌方法\灭菌工艺验证及无菌检查

Sterilization Methods，Validation of Sterilization Process and Sterility Testing for Medical Devices

Cheng Ling；Xu Yuyin；Gao Yong；Zhou Jing；Zhang Juanli

（He"nan Province Medical Instrument Testing Institute，Zhengzhou 450003，China）

摘要： 文章阐述了湿热灭菌、干热灭菌、环氧乙烷灭菌、辐射灭菌、低温等离子体灭菌等5种医疗器械灭菌方法，并介绍了灭菌工艺验证和无菌检查方面的内容。

Abstract: This paper describes five sterilization methods for medical devices, such as moist heat sterilization, dry heat sterilization, EO sterilization, radiation sterilization, low-temperature plasmas sterilization etc. The method of validation of sterilization process and sterility testing are introduced.

关键词： 灭菌 医疗器械 验证 无菌检查

Key words: sterilization；medical devices；validation；sterility testing

中图分类号：R2文献标识码：A文章编号：1006-4311（2011）29-0272-02

0引言

灭菌是用适当的物理或化学手段杀灭产品中一切活的微生物的方法；而消毒是杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。

无菌是指产品中不含任何活的微生物（包括细菌、真菌、病毒及芽孢）。然而，对于任何一批灭菌产品来说，绝对无菌是无法保证。已灭菌产品的无菌标准一般以物品灭菌后微生物存活的概率-无菌保证水平SAL（Sterility Assurance Level）表示。最终灭菌产品微生物存活的概率不得高于10-6（即100万件产品灭菌之后，只能允许有1件或以下可能有活的微生物存在），已灭菌产品的无菌保证状况可以通过验证实验证明[2]。

与粘膜、血液接触或植入到体内的医疗器械（例如一次性注射器、心脏导管、吸引管、人工关节、伤口护理敷料、血管支架、组织工程皮肤等）都要按照标准要求进行彻底灭菌。倘若这类医疗器械没有按照要求灭菌，非常容易引起感染，甚至导致生命危险。因此，灭菌工艺的控制和灭菌检测是保证医疗器械安全的一个关键环节。

1灭菌方法

1.1 湿热灭菌湿热灭菌是将产品放在压力锅内，利用饱和蒸汽在最小温度为121℃的压力下，热力和湿气被迅速传递给灭菌产品，灭菌时间至少15min。蒸汽潜热大，可迅速提高物体的温度，水分子穿透力强，容易使蛋白质凝固变性，所以湿热灭菌是热力灭菌中最常用、效果较可靠的一种灭菌方法。适用于湿热灭菌的医疗器械有：衣服、被单、聚四氟乙烯、外科手术器械、硅橡胶、聚丙烯、环氧树脂等。但对一些不耐高温的聚合物如聚氨酯等，承受不了这样的高温，只能采用其他的灭菌方法。

1.2 干热灭菌干热灭菌是将产品放于热空气箱中、利用干热空气的氧化作用，杀灭一切活的微生物或消除热原的方法。干热灭菌通常使用的温度较高，范围在160～250℃，依据其使用的温度，暴露的时间可达2h。干热灭菌条件一般为160×120min以上、180℃×60min以上或250℃×45min以上，也可采用其它温度和时间参数。实际应用中，干热灭菌的适用范围十分有限，一般应用于耐高温的玻璃器具和金属外科器械，另有些产品不仅要求达到必要的无菌水平，还要消除细菌内毒素（热原物质），应用其他的灭菌方法很难消除细菌内毒素，而干热灭菌的温度时间参数设置在250℃×45min，可以除去玻璃器具的热原物质。

1.3 环氧乙烷灭菌环氧乙烷灭菌是医疗器械领域比较常用的灭菌方法，环氧乙烷灭菌原理是通过其与蛋白质分子上的巯基（-SH）、氨基（-NH2）、羟基（-OH）和羧基（-COOH）以及核酸分子上的亚氨基（-NH-）发生烷基化反应，造成蛋白质失去反应基团，阻碍了蛋白质的正常生化反应和新陈代谢，导致微生物死亡，从而达到灭菌效果。

环氧乙烷灭菌时，灭菌柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时间都是影响灭菌效果的重要参数。一般采用的灭菌条件：温度（55±10）℃、相对湿度（60±10）%、灭菌压力8×105Pa灭菌时间120min。环氧乙烷是一种烷化剂，穿透力强，能够使用各种包装材料，在常温下能杀灭各种微生物（包括细菌、芽孢、病毒、真菌孢子等）[4]。适用于生物医用高分子材料，比如天然橡胶、聚乙烯、聚丙烯及聚氯乙烯等。环氧乙烷灭菌器包括一个防泄漏、防爆炸的钢制腔室，首先将灭菌腔内抽成真空，通过蒸汽调节腔内的物料温度和湿度，然后进一步抽真空，再通入经过预热的环氧乙烷气体。包装材料必须是对空气、蒸汽及环氧乙烷渗透性良好的，这样容易达到适宜的灭菌条件。由于环氧乙烷具有潜在的致癌性、致突变性、急性毒性反应，为了工作人员的安全，应在灭菌过程中，严密监控大气浓度和腔室的温湿度、压力、环氧乙烷气体浓度及灭菌时间。灭菌效果通常使用生物指示剂来监控[8][9]。灭菌器的控制具有一定难度，整个灭菌过程应在技术熟练人员的监督下进行。灭菌处理后，应通入过滤后的无菌空气，经历真空空气循环过程，使残留环氧乙烷安全去除。

1.4 辐射灭菌辐射灭菌是将灭菌产品放于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射产生自由基通过控制辐射条件而达到杀灭微生物的方法。灭菌用的γ射线通常以钴Co-60或铯Cs-137作为放射源，发生衰变时发射出1.33MeV和1.17MeV两个能级的射线，使微生物DNA受到不可恢复的损失，达到人们所需要的目标[3]。辐射灭菌通常用于外科器具、人工假体、注射器和缝合线等。

用辐射灭菌法灭菌的无菌产品其SAL应≤10-6，γ射线辐射灭菌监控的参数主要是辐射剂量。辐射剂量是依据标准细菌芽孢（短小芽孢杆菌芽孢）所允许的灭菌剂量计算值算出来的，同时应考虑灭菌产品的适应性，验证辐射剂量的有效性及安全性。辐射灭菌使用的剂量通常为25kGy。对某些医疗器械应在保证无菌的前提下尽可能采用低辐射剂量灭菌。钴Co-60辐射灭菌法验证时，除用生物指示剂验证试验外，还需要确认空载和装载时灭菌腔室内辐射剂量的分布图、灭菌产品的均一性、灭菌物品的吸收剂量及最大和最小吸收辐射剂量的分布、灭菌腔内产品的装载方式等[5][6]。

1.5 低温等离子体灭菌低温等离子体灭菌是最近几年才发展起来的新的低温灭菌技术。等离子体是气体或蒸汽受电场或磁场影响，使大部分分子发生离子化而形成的。等离子体灭菌器是由电源、激发原、气原、传输系统和灭菌腔室组成，抽真空后通过水蒸汽，蒸汽在电场作用下转变为等离子体。等离子体灭菌优点是杀菌效果可靠、作用温度低、灭菌后的器械不需要放置空气中去除残留气体，无腐蚀性[7]。目前，许多国家已开始应用这种技术，主要用于不耐热的医疗器械。

2灭菌工艺验证

灭菌工艺的验证是无菌保证的必要条件，灭菌产品的无菌保证取决于生产过程中适宜的的灭菌工艺、规范的GMP管理和严格的质量管理体系。灭菌工艺的确定应综合考虑生物负荷检测、环境监测、灭菌程序验证和无菌检查等。

2.1 生物负荷检测生物负荷是指产品中微生物数量或浓度，无菌产品所能达到的无菌保证水平取决于灭菌工艺及灭菌前的生物负荷。怎样在制造过程中减少微生物污染的概率就显得格外重要，因此，有必要使用高质量的原材料，制造环节尽量使用不利于微生物生长的条件，比如提高温度、降低PH值等。

2.2 环境监测为了保证微生物数量不超过规定限度，必须监控生产操作范围的微生物的水平。微生物可以从工作台面、固定设备和仪器的任何环节传播到产品中。因此，任何微生物可能聚集的死角都必须清除，所有的工作操作区域都必须保持干净、干燥和整洁。空气中掉落的微生物的尘埃和颗粒是常见的污染途径之一，空气中细菌、霉菌的数量的监测是将营养琼脂平皿置于空气中暴露一定的时间，孵育后计数菌落算出来的。

操作人员是另一个潜在的污染源，操作人员的衣服、手套和面罩都应取样，进行微生物种类与数量的评估，有必要对工作人员进行微生物学知识的培训。

2.3 灭菌程序验证灭菌程序验证是无菌产品灭菌操作过程中最复杂、最重要的环节。通常的灭菌程序验证需要撰写灭菌程序验证方案及制定评估相关标准，确认灭菌设备及监控设备在规定的参数范围内正常运行，提供依据以证实灭菌能达到预期效果，结合生物负荷使用生物指示剂，在“极差”的情况下灭菌工艺仍能达到无菌保证水平，上述检验需要至少三次及以上来证明结果的重复性和稳定性，综合上述结果，撰写验证报告。用于灭菌工艺中的生物指示剂是标准化的细菌芽孢制备品，它所应用的细菌种类须经严格挑选，非致病性，对特定灭菌工艺的耐受能力高于平均水平（表1）。

日常生产中，应对灭菌程序的运行情况进行监控，确认关键参数（如温度、压力、时间、相对湿度、灭菌气体浓度及辐射剂量等）均在验证确定的范围内。灭菌程序应定期再验证。当灭菌程序发生变更（包括灭菌物品装载方式和数量的改变）时，应进行再验证。

3无菌检查

无菌检查试验是通过将医疗器械或其浸提液接种于培养基内的方法来评价灭菌后的医疗器械是否有未杀死的微生物。依据《中国药典》，无菌检查试验主要有直接接种法和薄膜过滤法两种。

3.1 浸提液制备方法①管类器具：按管内表面积每10cm2流过管内腔1mL浸提介质，流量约为10mL/min。②容器类器具：容器内已装有液体的可直接抽取容器内液体为供试液；空容器按容器内表面积每10cm2加入浸提介质1mL，振摇数次。③实体类器具：实体类器具按表面积每10cm2加入浸提介质1mL，振摇数次。

3.2 直接接种法将产品或其有代表性的部分直接投放入营养培养基内。药典推荐两种培养基：①硫乙醇酸盐流体培养基内含有葡萄糖和巯乙醇酸钠，在30～35℃温度下培养，适宜于需氧细菌和厌氧性微生物的生长；②改良马丁培养基在23～28℃培养，适宜于真菌的生长。

3.3 薄膜过滤法当产品不适宜直接投放或产品有抑菌成分就要采用薄膜过滤法。具体做法是先进行无菌验证，然后用无菌氯化钠溶液或其他有机溶剂浸提产品，使浸提液通过装有孔径不大于0.45μm的薄膜过滤器，然后用0.9％无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜。之后将硫乙醇酸盐流体培养基与改良马丁培养基分别加至薄膜过滤器内（封闭式过滤器），或取出滤膜,分别加入上述二种培养基中，按药典规定的温度和时间培养。

3.4 结果判断当阳性对照管显浑浊并确证有细菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结果判定：如硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新加倍取样复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判供试品不合格[1]。

无菌检查不能保证每批产品的无菌，但它是产品出厂前的最后一道检查程序，坚持进行无菌检查有助于提高灭菌工艺及无菌操作效果的可信度。

参考文献：

[1]中华人民共和国药典（2010年版）北京：中国医药科技出版社，2010.

[2]袁洽劻，凌波.实用消毒灭菌技术[M].北京：化学工业出版社，2002.

[3]薛玲，林华，王辉.北京市医疗器械产品γ射线辐射灭菌调研[J].医疗器械导航.2007.9:4-5.

[4]朱瑞银，路蓓，何忠平.无菌医疗器械环氧乙烷灭菌的验证方法[J].中国医疗器械信息.2008.14（9）：10-17.

[5]朱南康，王春雷，滕维芳.医疗器械辐射灭菌的现状及进展[J].核技术.2003.（03）：189-196.

[6]王宏，丁增成，徐宏青.医疗卫生用品辐射灭菌·消毒的现状及发展趋势[J].安徽农业科学.2003.（02）：246-247.

[7]李莹，李柯，陈杰瑢，等.低温等离子体杀菌消毒技术的应用进展[J].化工进展.2004.（07）：718-722.

[8]ISO 11135-1:2007 Sterilization of health care products --Ethylene oxide -- Part 1: Requirements for development, validation and routine control of a sterilization process for medical devices.

[9]ISO 10993-7:2008 Biological evaluation of medical devices -- Part 7: Ethylene oxide sterilization residuals.

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