沈阳地区丙型肝炎患者的HCV基因分型研究

【摘要】目的了解沈阳地区慢性丙型肝炎患者的HCV基因分型情况,为丙型肝炎病毒的诊断和预防提供有力依据。方法根据丙型肝炎病毒RNA全序列,在5"NCR区设计引物,通过套式PCR扩增,特异性产物测序分型。结果检测HCV感染样本75例,共检出4种基因型,分别为1a,lb,2a和3a型,其中1a占2.7%,1b占54.6%,2a占32%,3a型占10.7%。结论沈阳地区HCV基因型主要为1b型,其次为2a型,与中国其它地区HCV基因型分布比较一致。

【关键词】丙型肝炎病毒;套式RTPCR;测序;基因分型

丙型肝炎病毒(HCV)感染和输血后肝炎密切相关。大部分HCV患者会逐步演变为慢性感染,并根据病程轻重发展为肝硬化或肝癌。由于HCV具有高度遗传异质性,基因型众多,每个患者都代表着某种独特的表现,因此,HCV的基因型是可靠且重要的治疗反应指标。本研究拟通过分析沈阳地区的慢性丙肝患者体内HCV病毒分型情况,为沈阳地区丙型肝炎病毒的临床诊断和疾病预防提供一定的实验依据。

1资料与方法

1.1标本75例HCVRNA阳性标本取自2007年8月至2008年12月本院门诊及住院患者,男47例,女28例,年龄17~68岁。取2mlEDTA抗凝全血后分离血清,70℃冻存备用。

1.2仪器ABI3130基因测序分析仪为美国应用生物系统公司(ABI)产品;PE9600型全自动PCR仪为美国应用生物系统公司(ABI)产品。

1.3试剂套式PCR引物由达安基因诊断中心提供:逆转录试剂购自德国QIAGEN公司:PCR检测试剂是深圳匹基公司产品。

1.4方法

1.4.1采用异硫氰酸胍(TRIZOL)一步法抽提血清中游离病毒RNA,75%乙醇洗涤RNA沉淀,DEPC处理水溶解RNA,80℃保存备用。

1.4.2套式RTPCR扩增

1.4.2.1引物设计合成引物根据HCV病毒RNA的全长序列设计,选择HCVRNA5"NCR区。

1.4.2.2cDNA合成取模板RNA5μl。5×缓冲液5μldNTPs1mmoL。引物R120pmol,反转录酶MMLV200U、RNasin20U(Promega),加DEPC水补足至25μl,混匀,全自动PCR仪37℃1h,95℃5min。

1.4.2.3套式PCR外扩增取上述cDNA5μl进行PCR扩增,5×缓冲液10μl,外引物各25pmol,dNTPs200μmol,MgC121.5mmol/L,Taq酶2.5U,加ddH20补充至50μl,用灭菌石腊油覆盖液面。置全自动PCR仪94℃预变性7min后,再依次25个循环,每次循环条件为93℃1min,54℃50S,72℃1min,最后72℃延伸10min,得到外扩增PCR产物。

1.4.2.4套式PCR内扩增取上述外扩增PCR产物5μl为模板,5×缓冲液10μl,内引物各25pmol,dNTPs200μmol,MgC121.5mmol/L,Taq酶2.5U,加ddH20至50μl,用灭菌石腊油覆盖液面,置全自动PCR仪94℃预变性7min后,再依次循环35次.每次循环条件为93℃1min,55℃1min。72℃1min,最后72℃延伸10min.得到内扩增PCR产物。

1.4.3上述内扩增PCR产物加入基因测序试剂,ABI3130基因测序分析仪测序分析

2结果

HCV测序分型结果实验共75份血清标本,其中1a型2例(2.7%),1b型41例(54.6%),2a型24例(32%),3a型8例(10.7%)。

3讨论

HCV为单股正链RNA病毒。是输血后肝炎的最主要的原因,亦是导致肝硬化和肝癌的重要原因之一,近年来国内外已对数十个HCV全基因或片段基因进行了序列分析,发现HCV有6种基因型(16)和11种亚型(1a_c2a_c3a_c4a5a6a)[13],给临床的诊断带来一定的难度。根据其基因序列进行分型,可从分子生物学的角度对HCV的高变异性增加更多的认识,对进一步研究HCV病毒的流行病学规律,为丙型肝炎的临床诊断和治疗方法的改进提供更多的依据。HCV病毒分型具有一定的地域性,1a多见于欧美地区,1b和2a型在亚洲地区分布广泛,4型多分布于印度、北非及中东地区[4],我国多见lb、2a型。本研究收集了沈阳地区慢性丙型肝炎患者75例,用套式RTPCR方法扩增病毒RNA并通过测序鉴定,检测了患者血清中HCV的分型情况,结果表明所检测患者共有4种HCV基因型的分布,分别为1a,1b,2a和3a型,其中1a型2例(2.7%),1b型41例(54.6%),2a型24例(32%),3a型8例(10.7%),lb为主要的流行型别,与中国其它地区HCV的研究报道结果比较一致[56]。作为HCV分型最准确可靠的方法,本研究采用套式RTPCR方法扩增特异性HCV基因片段,进行核苷酸序列测定分析确定基因型别,研究了沈阳地区HCV患者的病毒基因分型情况,从分子生物学的角度初步反映了该地区HCV病毒的型别分布。由于本研究收集样本的数量有限,进一步的研究应加大样本量.为HCV所致肝炎的疾病控制和诊断治疗提供更多的实验依据。

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