大蒜辣素对大鼠心肌梗死后纤维化的影响及与TGFβ/Smads信号通路的关系

材料

1.1 动物 健康清洁级Wistar大鼠60只，雄性，体重（220±20） g，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号SCXK（京）2011-0004。

1.2 药品与试剂 大蒜辣素由新疆埃乐欣制药有限公司提供；盐酸地尔硫艹卓由福建省闽东力捷迅药业有限公司生产（批号130801A）；Masson染色试剂盒购于南京建成生物工程研究所；兔抗TGFβ₁多克隆抗体，即用型SABC免疫组化试剂盒，DBA显色液购于武汉博士德生物工程有限公司；Smad3，7抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。

2 方法

2.1 实验动物分组及给药 大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、地尔硫艹卓注射液组（1.5 mg·kg^-1）和大蒜辣素注射液低剂量组（1.2 mg·kg^-1）、中剂量组（1.8 mg·kg^-1）和高剂量组（3.6 mg·kg^-1）。各组分别于造模后第2天开始腹腔注射给药，假手术组和模型组注射相应体积生理盐水。连续给药21 d。

2.2 大鼠急性心肌梗死模型制作 按文献介绍的方法[5-6]制备大鼠心肌梗死模型。大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛（1 mL·kg^-1）麻醉后，经左侧第四肋间剪开皮肤，分离组织后打开胸腔，然后将心包膜剪开，挤出心脏，迅速于左冠状动脉前降支起点2 mm处穿线结扎左冠状动脉前降支，将心脏放回胸腔后缝合胸腔及皮肤。假手术组于冠状动脉处只穿线而不结扎。术后心电图检测心肌缺血情况，第2天开始腹腔注射给药，给药21 d后取心脏检测指标。

2.3 心肌Masson染色 于结扎线水平横断心脏，取下半部分心肌组织用4%多聚甲醛固定，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片。Masson染色后，在光学显微镜下观察大鼠心肌组织形态学改变。

2.4 免疫组化检测心肌组织Ⅰ，Ⅲ型胶原及TGFβ₁，Smad2和Smad7的表达 按照免疫组化试剂盒说明书进行免疫组化操作，具体为：3% H₂O₂甲醇溶液中封闭内源性过氧化物酶；0.1 mol·L^-1枸橼酸缓冲液抗原修复20 min；10%兔血清封闭30 min；然后加入上述指标的Ⅰ抗（1∶50稀释）工作液于组织上，4 ℃孵育16 h；用标记有辣根过氧化物酶及羊抗鼠Ⅱ抗于组织上，室温孵育 2 h；DAB显色后于光学显微镜下观察蛋白表达情况并照相。采用 Image-Pro 5.1图像分析软件，每张切片随机选取5个视野进行半定量方法测定免疫组化图像灰度分析积分光密度（IOD）。

2.5 统计学分析 数据以±s表示，数据分析采用SPSS 19.0，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠心肌组织Masson染色 假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，心肌细胞间质略有少量胶原纤维，基本无成纤维细胞增生；模型组残留心肌细胞数目少，心肌纤维化严重，大量心肌细胞被胶原纤维代替。大蒜辣素高剂量组心肌细胞相对模型组完整，较少部分被胶原纤维代替，心肌纤维化程度明显改善；大蒜辣素中、低剂量组，心肌细胞肥大排列不规则，少量心肌细胞被胶原纤维代替，相比高剂量组胶原纤维化程度重（图1）。

3.2 各组大鼠心肌组织Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达 模型组有大量棕褐色着色细胞的表达；假手术组未见明显棕色着色细胞的表达；与模型组相比，大蒜辣素高、中、低3 个剂量组棕色细胞表达相对模型组显著减少。提示模型组在心肌非梗死区Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达增高；假手术组则胶原蛋白表达较少；而大蒜辣素可降低心肌非梗死区Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达。对各组Ⅰ和Ⅲ型胶原吸光度测定结果也显示，与模型组相比，大蒜辣素各组均可在一定程度上降低Ⅰ和Ⅲ型胶原的表达量（P<0.05）（图2，3，表1）。

3.3 TGF-β，Smad3和Smad7蛋白表达 模型组大鼠心肌中TGF-β₁，Smad3表达明显增加，Smad7 表达明显减少，提示心肌梗死21 d后，TGF-β/Smads 通路中促纤维形成因子表达增强、抑制纤维形成因子减少。大蒜辣素治疗21 d后，与模型组比较，中、高剂量组显著抑制大鼠非梗死区心肌中TGF-β₁和Smad3的表达，而Smad7 的表达增加。证实大蒜辣素可以通过影响TGFβ/Smads信号通路抑制心肌纤维化（图4～6，表2）。

4 讨论

心肌纤维化时心肌组织胶原纤维大量沉积，取代正常的心肌细胞，致使心脏收缩能力下降和顺应性降低，严重影响心脏功能。因此，心肌纤维化是心肌梗死后心功能减退的主要原因。本研究结果显示大蒜辣素可以通过影响TGFβ₁/Smads信号通路而对心肌梗塞模型大鼠心肌纤维化产生抑制作用。

心肌梗死后往往伴随一系列的炎症反应，而这些炎症反应在修复心肌损伤的同时也是导致后期梗死区和非梗死区心肌纤维化的主要原因，在纤维化发生发展过程中起了重要作用[7-8]。

因此，通过抑制心肌梗死后的炎症过程，可抑制梗死后心肌重塑，改善心肌纤维化过程。研究显示，大蒜辣素具有抗炎及抗氧化作用，进而保护高血脂动物血管内皮功能[9-10]。同时，在糖尿病大鼠模型中也发现，大蒜辣素可以抑制心肌细胞凋亡而改善心肌纤维化的发生[11]。由此可推断，大蒜辣素可通过抗炎作用抑制心肌梗死后心肌纤维化的发生。本实验结果显示，大鼠心肌梗死21 d后，模型组梗死区周围纤维组织产生量明显增多，而大蒜辣素治疗组较模型组纤维组织沉积较少。说明大蒜辣素可减轻心肌梗死后非梗死区的心肌纤维化。

TGFβ₁是心肌纤维化发生过程中最重要的因子之一，可以通过多种信号转导通路促进心肌纤维化的发生、发展，而TGFβ₁/Smads通路是最重要的促心肌纤维化通路。Smads蛋白是参与TGFβ细胞内信号传导的一组蛋白质，共有9种，分别为Smad1～Smad9，其中Smad2，3是参与TGFβ促纤维化的主要蛋白。TGFβ可以通过细胞内Smad2，3促进成纤维细胞的增殖、分化，促进心肌细胞外基质的产生和沉积[12-13]。而Smad7为抑制型Smad蛋白，对TGFβ₁/Smads信号通路起负反馈作用[14]。研究发现，心肌梗死后，TGFβ₁和Smad2，3表达明显升高，而Smad7表达水平将降低[15]。药物可通过抑制TGFβ₁及Smad3、促进Smad7表达对心肌纤维化产生治疗作用[16]。

本研究发现，正常心肌TGFβ₁和Smad3蛋白表达量较低，而心肌梗死后二者表达量增加，Smad7表达量降低。经大蒜辣素治疗后，TGFβ₁和Smad3表达量明显降低，同时Ⅰ，Ⅲ型胶原的表达量也降低，说明大蒜辣素可以下调TGFβ₁和Smad3表达而抑制心肌纤维化的发生。同时，大蒜辣素干预后，心肌Smad7表达量显著增加，提示其作用可能也与上调Smad7表达有关。

综上所述，大蒜辣素具有抑制心肌梗死后心肌纤维化发生的作用，这一作用的发生与调节TGFβ₁/Smads信号通路有关。大蒜辣素可通过下调TGFβ₁和Smad3表达，上调Smad7表达改善心肌梗死后纤维化的发生。

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[责任编辑 马超一]

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