HO—1对肺气肿大鼠ICAM—1、MIP—2表达的影响

[摘要] 目的 观察HO-1对肺气肿大鼠模型肺组织ICAM-1和MIP-2表达的影响。方法 复制肺气肿大鼠模型，并用Hemin干预，收集BALF行细胞计数并分类检查；采用免疫组织化法检测大鼠支气管肺组织HO-1、ICAM-1表达，ELISA方法检测肺组织匀浆中MIP-2的含量。结果 与模型组比较，干预组肺组织中HO-1表达显著增加（P<0.05）。肺气肿组大鼠模型中不仅ICAM-1在支气管肺组织的表达较干预组显著增加（P<0.05），而且BALF中的白细胞计数和中性粒细胞计数均与ICAM-1表达呈显著正相关（r=0.85、0.84，P均<0.01）；模型组肺组织匀浆中MIP-2含量较干预组明显增加，而且BALF中的白细胞计数和中性粒细胞计数均与MIP-2含量呈显著正相关（r=0.89、0.89， P均<0.01）。 结论 ICAM-1和MIP-2在肺气肿中明显增加，HO-1可降低ICAM-1、MIP-2的表达，这可能是HO-1在肺气肿中抗炎反应的作用机制之一。

[关键词] 血红素加氧酶-1；肺气肿；ICAM-1；MIP-2

[中图分类号] R563.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）11-0007-03

[Abstract] Objective To observe the effect of HO-1 on expressions of ICAM-1 and MIP-2 in lung tissue of rats with emphysema. Methods Established emphysema rat models and using Hemin to interven. BALF were collected to count the total and differential cell counts. HO-1 and ICAM-1 expressions in pulmonary tissues of rat were detected by immunohistochemistry. The content of MIP-2 in lung tissues was detected by ELISA. Results Compared to the emphysema group， the expression of HO-1 in control group were significantly positive（P<0.05）. The expression of ICAM-1 in lung of the emphysema group was significantly higher than those in control group （P<0.05） and was positively correlated with the leukocyte numbers and neutrophil in BALF in the model group（r=0.85， 0.84 respectively， P all <0.01）. The content of MIP-2 in lung tissues of the emphysema were significantly higher than those in control group（P<0.05）. In the model group， the leukocyte numbers and neutrophil in BALF were positively correlated with the levels of MIP-2 in lung tissues（r=0.89， 0.89 respectively， P all <0.01）. Conclusion HO-1 might significantly alleviate emphysema by inhibiting the expressions of ICAM-1 and MIP-2.

[Key words] Heme oxygenase-1； Emphysema； ICAM-1； MIP-2

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种可以预防和治疗的疾病，主要累及肺部，也是导致高致残率和高致死率的一种常见呼吸系统慢性疾病[1]。其发病机制尚不完全清楚，一般认为COPD是以气道的慢性炎症为主要特征，由多种炎性细胞、细胞因子、炎症介质共同作用。血红素加氧酶（HO）是血红素分解代谢的限速酶，研究发现血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增生的细胞保护效应。目前对于HO-1在肺部疾病中作用的研究已有了突破性进展，研究证实血红素加氧酶-1参与了COPD、肺动脉高压、哮喘等的发生、发展[2-4]。有研究表明吸烟可诱导COPD患者气管平滑肌细胞HO-1表达增加[5]，HO-1对氧化应激的异常反应可能与COPD的发生有关，小鼠肺组织腺病毒介导的HO-1 cDNA 转染能明显减轻其弹力蛋白诱导的肺气肿[6]。Yamada等[7]研究发现，HO-1基因的多态性与肺气肿易感性相关。这表明HO-1在COPD的发病过程中具有一定的保护作用，但目前其机制尚不完全清楚。本研究通过干预肺气肿大鼠HO-1表达，观察其病理变化并检测大鼠支气管肺组织细胞间黏附分子1（ICAM-1）的表达和肺组织匀浆巨噬细胞炎症蛋白2（MIP-2）的含量，探讨ICAM-1和MIP-2与肺气肿发病机制的关系；通过观察HO-1对ICAM-1、MIP-2的影响，探讨其在肺气肿防治中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物与主要试剂

雄性Wistar大鼠（山西医科大学实验动物中心提供）18只，体重（200±20）g，HO-1抗体（美国Abcam公司），ICAM-1抗体（武汉博士德公司），MIP-2酶联免疫吸附试剂盒（武汉博士德公司）。

1.2 动物分组与造模

8周龄健康雄性Wistar大鼠18只，适应性饲养两周，随机分为3组，每组各6只：①正常未暴露组（对照组）；②烟雾暴露组（模型组），将大鼠放入自制的玻璃箱中，每日用点燃的猴王牌香烟（焦油11 mg/支）熏约10 min，掀开箱盖休息5 min，重复烟雾暴露，每日2次上述烟雾暴露，每周5 d，连续20周；③Hemin+烟雾暴露组（干预组），在每周首次烟雾暴露前24 h开始腹腔注射Hemin 25 μmol/kg，连续3 d，而对照组和模型组均用等毫升生理盐水腹腔注射。20周时同时处死3组实验动物取材做相关检测。

1.3 BALF的白细胞计数及分类计数

实验动物用戊巴比妥麻醉固定，处死，开胸，游离出双肺及气管，结扎右主支气管，用5 mL注射器从气管下部注入生理盐水3 mL反复灌洗3次，回收率在80%以上。使用毛细吸管吸取新鲜制备混匀的 BALF，在显微镜下行白细胞计数。剩余的BALF立即在4℃下离心（2000 rpm，8 min），离心后取沉渣物涂片，采用瑞氏染色法按细胞形态学行细胞分类计数。

1.4 肺组织标本制作

取大鼠右肺上叶肺组织，置于10%甲醛液中固定，石蜡包埋后行HE染色，并行病理形态学观察和免疫组化检测。取右肺下叶肺组织，研磨成匀浆，行酶联免疫吸附试验检测。

1.5 肺组织中HO-1和ICAM-1的检测

用免疫组化SP法检测肺组织HO-1表达水平的变化，采用SABC法检测支气管肺组织ICAM-1表达水平的变化，操作步骤按试剂盒说明书进行。阴性对照标本以PBS缓冲液作为一抗。以肺组织中出现棕黄色或棕黄色颗粒作为阳性结果，用BI-2000 医学图像分析系统检测HO-1、ICAM-1光密度值。

1.6 MIP-2的检测

采用ELISA法测定肺组织匀浆MIP-2的含量。

1.7 统计学处理

应用统计软件SPSS16.0进行统计分析，结果均以（x±s）表示，均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验法，相关性检验用直线相关分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF白细胞计数及分类

2.2大鼠支气管及肺组织病理学检查

光镜下观察：对照组支气管上皮细胞排列整齐，管壁及周围无明显炎症变化；肺气肿模型组各级支气管纤毛柱状上皮细胞部分变性、坏死，肺泡结构紊乱，肺泡壁变薄、破坏，肺泡腔扩大，肺泡间隔变薄或断裂；干预组上述改变均有不同程度的减轻。见封三图1。

2.3 肺组织HO-1的免疫组织化表达

正常对照组大鼠肺组织可见胞质内少许HO-1弱阳性表达的细胞。肺气肿模型组HO-1的表达较对照组明显增加（P<0.05）；与模型组比较，干预组肺组织中HO-1表达显著增加（P<0.05）。见表2。

2.4 支气管肺组织ICAM-1的免疫组织化学染色结果

肺气肿模型组肺组织表达高水平ICAM-1蛋白，肺组织呈棕黄色，表达于肺微血管内皮、肺泡细胞以及支气管上皮细胞，肺气肿模型组可见ICAM-1蛋白表达较正常对照组增加，染色变深。Hemin干预组中大鼠ICAM-1蛋白表达较肺气肿模型组显著降低（P<0.05），但仍比正常对照组高（P<0.05）。见表2。

2.5 肺组织匀浆中MIP-2含量

与对照组比较模型组MIP-2含量明显增加（P<0.05）；干预组MIP-2含量较模型组减少，但仍高于对照组（P<0.05）。见表2。

2.6 肺气肿模型组数据间相关性分析

BALF中的白细胞计数和中性粒细胞计数均与ICAM-1表达呈明显正相关（r=0.85、0.84， P均<0.01）；同时BALF中的白细胞计数和中性粒细胞计数与MIP-2含量呈显著正相关（r=0.89、0.89， P均<0.01）。

3 讨论

COPD 的发病是一种复杂的病理过程，迄今为止其发病机制尚未完全清楚，虽然许多研究表明COPD的发生、发展是由多种机制参与，但目前多数研究者认为慢性气道炎症是最主要的发病机制。

HO-1在大多数组织中呈低水平表达，当受到高氧、热休克、内毒素、过氧化氢、细胞因子等刺激时可产生高水平表达。研究显示，在应激状态下，HO-1通过调控促炎细胞因子和抗炎细胞因子释放，起到保护脏器功能的作用[8，9]。本实验通过Hemin诱导HO-1的表达，观察其病理学改变及肺组织ICAM-1表达与肺组织匀浆中MIP-2含量，以探讨HO-1对肺气肿的保护作用及其作用机制。本实验结果显示，与模型组比较，干预组HO-1表达明显升高，肺泡及肺间质病变明显减轻，同时BALF中白细胞、中性细胞数目明显减少， 说明血红素加氧酶对烟雾暴露诱导的肺气肿具有明显的保护作用。

ICAM-1是细胞黏附分子的免疫球蛋白超家族，为76～114kD的单链糖蛋白，其配体为巨噬细胞黏附分子-1、淋巴细胞功能相关抗原-1，两者均属于β2整合素，ICAM-1与β2整合素的黏附是白细胞跨越血管内皮转移的关键[10]，也是白细胞在气道聚集的必要条件[11]。

实验发现，肺气肿模型组支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞及支气管肺组织微小血管内皮细胞ICAM-1表达水平明显高于正常对照组（P<0.05），BALF中的白细胞、中性粒细胞数量与肺组织中ICAM-1的表达呈显著正相关（r=0.85、0.84，P<0.01），这与黄玲媚等[12]研究一致，表明ICAM-1与肺气肿气道内炎症细胞的聚集、浸润有关。本实验Hemin干预组肺组织中ICAM-1表达水平低于模型组，张全等[13]在急性肺损伤研究中发现HO-1可通过阻断NF-κB激活的信号通路减少ICAM-1的表达，说明HO-1能通过下调肺内ICAM-1的表达增加，对肺脏起保护作用。

研究发现，一些特异性的趋化因子在白细胞聚集与活化的炎症反应过程中起重要作用。MIP-2是分子量6kD的碱性蛋白质，由“α”和“β”两种蛋白质亚单位组成，其cDNA编码有100个氨基酸，成熟的蛋白质有73个氨基酸残基。MIP-2由巨噬细胞、血管内皮细胞等分泌，属于趋化性细胞因子中C-X-C亚家族成员。MIP-2可通过自身的肝素结合位点促进白细胞与内皮细胞外基质中硫酸乙酰的葡聚糖相互作用，加强白细胞与内皮细胞的黏附[14]。MIP-2通过对炎症细胞的化学趋化和活化作用而参与炎症的全过程，特异靶细胞为中性粒细胞，对其他炎症细胞作用微弱。

实验发现，模型组肺组织匀浆中MIP-2显著高于对照组（P<0.05），且肺组织匀浆中MIP-2含量与BALF中的白细胞数及中性粒细胞数呈显著正相关（r=0.89、0.89，P<0.01），这与罗曼等[15]在COPD大鼠模型中的研究结果相一致。提示MIP-2通过对中性粒细胞的特异性趋化作用促进中性粒细胞在肺气肿大鼠气管、肺组织中的聚集、活化；说明MIP-2通过作用于中性粒细胞诱导了气道炎症和肺组织损伤，参与了肺气肿发病。干预组肺组织匀浆中MIP-2含量均较模型组减低，这与Minamino等[16]在低氧性肺损伤研究中高表达HO-1的肺组织MIP-2水平显著下降结果相一致，表明血红素加氧酶-1可通过其抗炎能力减少肺内MIP-2生成，从而减轻肺部炎性损伤，起一定的保护作用。

综上所述，本实验证实HO-1的抗炎作用，其机制可能为通过某种途径减少ICAM-1和MIP-2的产生，进而干预炎症细胞的聚集、浸润、活化，这或许是其减轻肺组织损伤、起到对肺脏的保护作用机制之一；但其具体作用机制尚不清楚，需更进一步研究。

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（收稿日期：2014-01-07）

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