清心开窍方及皂苷对AD大鼠学习记忆能力及脑组织凋亡信号转导分子，Aβ及βAPP表达的影响

[摘要]　目的：探讨清心开窍方及其皂苷成分对Aβ2535杏仁核注射诱导AD大鼠学习记忆能力及脑组织凋亡信号转导分子，Aβ及βAPP表达的影响。方法：雄性SD大鼠40只，随机分为正常组、模型组、安理申组、清心开窍方组和皂苷组，每组8只。采用双侧杏仁核注射Aβ2535（10　g·L　-1）制造AD大鼠模型，造模后第2天起，分别灌胃给药安理申（167　mg·kg-1）、清心开窍方水煎剂（1267　mL·kg-1）、皂苷（630　mg·kg-1）及双蒸水，2周后，观察大鼠水迷宫空间记忆能力，并通过免疫组化方法研究脑组织Caspase3，Aβ及βAPP的表达。结果：中药各组能明显改善AD大鼠学习记忆能力，与对照组比较有显著性差异（P＜005，P＜001）；清心开窍方组、皂苷组大鼠大脑皮层、海马区Caspase3，Aβ及βAPP表达水平降低，与模型组比较差异非常显著（P＜001，P＜005）。结论：清心开窍方及其皂苷能显著改善AD大鼠学习记忆的能力，可能是通过降低皮质、海马Caspase3，Aβ及βAPP表达发挥作用。

[关键词]　阿尔茨海默病；清心开窍方；凋亡信号转导分子；β淀粉样蛋白

1　材料与方法

11　动物　SPF级SD大鼠40只，雄性，体重（250±20）　g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（湘）20090004。

12　药物与试剂　Aβ2535由北京博奥森生物技术有限公司生产，聚集态Aβ2535按说明书配置。清心开窍方由生地6　g、麦冬6　g、白芍6　g、石斛6　g、丹皮6　g、茯神6　g、陈皮4　g、知母5　g、石菖蒲6　g等组成，湖南中医药大学附属第一医院药剂科提供。经水提醇沉法得到80%的初提药液，然后采用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等提取分离，得到含70%总皂苷成分的清心开窍方有效部位[5]；盐酸多奈哌齐片（安理申），卫材（中国）药业有限公司生产，批号100223A，蒸馏水制成浓度50%的混悬液。Caspase3免疫组化试剂盒，Aβ免疫组化试剂盒，βAPP免疫组化试剂盒，SABC试剂盒，DAB显色剂由武汉博士德生物工程有限公司提供。

13　仪器　BMJ1生物组织包埋机（天津航空机电公司）；Shandon325型石蜡切片机（英国Shandon公司）；DNP9162型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；LEICA　DM　LB2型双目显微镜（德国LEICA公司）；Motic　B5显微摄像系统（麦克奥迪实业集团公司）；MIAS医学图象分析系统（北航公司）。

14　痴呆模型制备　大鼠经环境适应性饲养1周后，于造模前进行Morris水迷宫训练[6]3　d，剔除差异明显者。选取32只，参照文献方法[79]，将Aβ2535注入大鼠双侧杏仁核制备AD模型。2%戊巴比妥钠（40　mg·kg-1）腹腔注射麻醉，脑立体定位仪固定头部，常规消毒皮肤，在颅顶中线做长2～3　cm的切口，分离骨膜，暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱，立体定位杏仁核（以前囟为零点，AP　－32　mm，ML　±45　mm，DV　85　mm）后，牙科钻钻开颅骨，用微量注射器将1　μL（10　g·L　-1）的Aβ2535分别在5　min内缓慢注入双侧杏仁核，留针5　min，去针以局部软组织封闭针孔，缝合手术切口并消毒。

15　动物分组及给药方法　大鼠造模称重后随机分为模型组、安理申组（167　mg·kg-1）、清心开窍方水煎剂组（1267　mL·kg-1）及清心开窍方总皂苷组（630　mg·kg-1），每组8只。另选取8只为正常对照组。依标准动物体质量法[10]，清心开窍方组、皂苷组及安理申组分别给予相当于60　kg成人用药量的20倍。正常组、模型组给予等量双蒸水灌胃，各组均于造模后第2天灌胃干预，每天1次，连续2周。水迷宫测试期间于测试前30　min给药。

16　行为学检测　每次给药结束后进行Morris水迷宫测试，在水池中注入清水，水面高出平台2　cm，水温控制在（21±15）　℃。平台置于某一象限中间，在其他3个象限中任选一入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠逃避潜伏期及跨越平台次数。逃避潜伏期采用定位航行实验[6]。大鼠面向池壁从A，B，C，D入水点放入水中，观察其在60　s内寻找到并爬上平台的时间。若60　s未找到平台，实验者将其牵引至平台上，停留10　s后放回笼中，潜伏期记为60　s，每天2次，连续5　d。跨越平台次数采用空间探索实验[6]。第6天撤除平台，记录大鼠在60　s　内跨越平台相应位置的次数。重复2次，取平均值。

17　大鼠大脑皮层与海马区Caspase3，Aβ及

βAPP检测　第15天处死动物，冰台上迅速取出大脑组织，放入4%多聚甲醛固定液中固定，将固定好的大脑组织取出，室温下经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片厚度5　μm。按照免疫组化试剂盒说明书进行染色与检测，采用图像分析系统，每组选取6张切片，每张切片随机观察5个视野，精确选取视野内所有阳性颗粒，计算机自动算出面密度（阳性目标总面积/统计场总面积），用于定量表达免疫组化阳性反应程度。

18　统计学方法　采用SPSS　160软件，实验数据以±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间方差分析采用F检验，组间比较采用SNKq检验，P＜005为差异有统计学意义。

2　结果

21　大鼠学习记忆能力和空间探索能力比较　各组大鼠第1，2天逃避潜伏期比较，差异无统计学意义；与正常组比较，模型组第3～5天逃避潜伏期明显延长，跨越平台次数减少，差异有统计学意义（P＜001）；与模型组比较，各用药组第3～5天逃避潜伏期均缩短，跨越平台次数增加，差异有统计学意义（P＜001，P＜005），见表1。

3　讨论

由于AD主要病理特征是老年斑（senile　plaque，SP），神经元纤维缠结（neurofibrillary　tangles，　NFT），神经元大量丢失。而SP的核心成分为β淀粉样蛋白（βamyloid，　Aβ），由39～43个氨基酸组成，因此，目前普遍认为聚集状的Aβ具有神经毒性，越来越多的证据证明Aβ在脑内沉积是AD早期的主要病理变化[1112]。Aβ来源于βAPP，含有Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域（Kunitz　protease　inhibitor　domain，KPI）的βAPP可能通过抑制Aβ的降解增加局部Aβ的浓度[13]。大量证据表明细胞凋亡

表2　大鼠大脑皮层与海马区Caspase3，Aβ及βAPP表达水平比较（±s，n=6）

Table　2　Comparison　of　expression　level　of　Caspase3，Aβ　and　βAPP　in　the　cerebral　cortex　and　hippocampus　of　rat（±s，n=6）

参与了AD神经元的变性。细胞凋亡是多基因控制的细胞主动死亡过程，受促凋亡基因和抑凋亡基因的协同控制，而半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）主要在凋亡的下游事件中发挥促凋亡作用。最新研究证实了Caspase介导的APP切割产物与Aβ共定位于AD老年斑中。可见Caspase在调节神经毒性Aβ的生成及在AD神经元最终的凋亡中有着极其重要的作用[14]。

基于Aβ在AD发病过程中的重要作用，自1984年Glenner[15]从SP中分离出Aβ以来，许多学者一直在研究采用Aβ不同片段脑内注射制作AD模型[16]。大量研究表明，Aβ脑内注射大鼠模型可以作为一种类AD动物模型用于AD的研究[17]。

本实验所采用方药源自明代著名医学家张景岳《景岳全书》中的“蛮煎”，　由生地黄、麦冬、芍药、石菖蒲、石斛、牡丹皮、茯神、陈皮、知母、去木通，加苦参而成，具有清心凉血开窍功效。张景岳在《景岳全书》中指出：“痴呆症凡平素无痰而或以郁结，或以不遂，或以思虑，或以疑惑，或以惊恐而渐致痴呆，言辞颠倒，举动不经，或多汗，或善愁，其证则千奇万怪，无所不至，脉必或弦或数，或大或小，变易不常。此其逆气在心，或肝胆二经气有不清而然，但察其形体强壮，饮食不减，别无虚脱等证，则悉宜服蛮煎治之，最稳最妙”，并谓此方：“性味极轻极清，善入心肝两脏，行滞气，开郁结，通神明，养正泻邪，大有奇效”。　清代名医徐灵胎认为：“苦参以苦为治也，苦入心，寒治火，故苦参专治心经之火”，与黄连功用相近。现代研究发现苦参能明显抑制小鼠的自主活动，拮抗苯丙胺和咖啡因的中枢兴奋作用，增强戊巴比妥钠及水合氯醛的中枢抑制作用[4]。蛮煎是用于治疗AD的有效方剂，已广泛运用于临床多年，且疗效显著，尤其对早期出现症状者效果更佳，临床治疗AD能明显改善患者的认知功能障碍、行为和精神症状等[24]。

课题组自2004年开始通过动物试验来阐释清心开窍方治疗AD的疗效与机制，结果显示，清心开窍方水煎剂能明显改善由AlCl3灌胃导致痴呆的AD小鼠学习记忆能力，降低AD小鼠脑组织中NO，NOS含量及AchE　活性，降低氧自由基对机体的损伤，明显改善海马神经细胞的破坏，与模型组比较有统计学意义（P＜001，P＜005）[1821]。

本研究在以往研究的基础上采用Aβ2535双侧杏仁核注射法，通过Aβ的毒性作用制作AD大鼠模型，以清心开窍方及其总皂苷进行治疗，结果显示中药各组能明显改善AD大鼠学习记忆能力，与模型组比较差异显著（P＜001，P＜005）；清心开窍方组、皂苷组大鼠大脑皮层与海马区Caspase3，Aβ，βAPP表达水平降低，与模型组比较差异非常显著（P＜001，P＜005）。清心开窍方通过降低Caspase3，下调Aβ及βAPP，以减轻细胞凋亡而改善AD大鼠学习记忆的能力，可能是清心开窍方治疗AD的重要机制之一。

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