全反式维甲酸联合丙戊酸钠诱导白血病细胞分化过程中BRD4表达变化及其作用的研究

摘要]目的 探讨全反式维甲酸（ATRA）联合丙戊酸钠（VPA）诱导HL-60细胞分化过程中BRD4表达调控的分子机制。 方法 建立ATRA联合VPA诱导白血病细胞株HL-60的分化模型，瑞氏-吉姆萨（Wright-Gimesa）染色观察HL-60细胞形态，流式细胞术检测细胞表面分化抗原的表达，蛋白质印记从蛋白水平检测HL-60细胞经药物诱导24、48、72 h后BRD4表达的变化。 结果 单独应用ATRA或VPA均能够明显抑制白血病细胞生长，诱导细胞分化，倒置显微镜下可观察到HL-60细胞向成熟粒细胞方向分化，细胞表面的分化抗原表达升高，联合诱导分化模型中细胞表面分化抗原表达升高更明显，两者均有统计学意义，在蛋白水平BRD4的表达逐渐降低，联合诱导分化模型中降低更明显，两者有统计学意义。 结论 VPA可以明显的促进ATRA诱导白血病细胞的分化作用，BRD4基因的表达在随着分化程度的加强出现逐渐降低的趋势。

[关键词]白血病；诱导分化；全反式维甲酸；丙戊酸钠；BRD4

[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）07-30-04

药物，已经证实其在临床剂量范围内有着组蛋白乙酰化酶（HDAC）抑制剂的特征性作用，能够提高组蛋白乙酰化水平，使组蛋白与DNA结合增强，进而促使靶基因转录，纠正基

因表达的调控异常，最终可以诱导肿瘤细胞分化与凋亡[1]。体外实验证实，其能抑制多种白血病细胞生长。目前，已有大量实验证明组蛋白乙酰化酶抑制剂（HDACi）代表药物VPA可以明显促进全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）诱导白血病细胞株HL-60的分化作用[2-4]。

BRD（a double bromodomain-containing protein）是bromodomain BET家族成员，包含2个溴基结构的蛋白，可优势结合乙酰化染色质，从而改变染色质构象。研究已发现，BRD4（a double bromodomain-containing protein 4）在基因组复制、转录、细胞周期调控、肿瘤发生及病毒基因组分离等过程中均起关键性作用。2011年9月国外首次有文献报道[5]，BRD4作为治疗急性髓系白血病的一种核苷酸调控靶点，用shRNA或者小分子抑制剂在体内外抑制BRD4可以引起稳定的抗白血病作用，包括终末骨髓的分化和白血病干细胞的消除。但在白血病诱导分化治疗中，BRD4表达、靶向调控BRD4表达后在诱导分化中的作用至今仍不十分明确。本研究通过建立全反式维甲酸联合HDAC抑制因子的诱导的白血病细胞分化模型，以探讨不同诱导分化剂对白血病细胞株HL-60中BRD4表达变化的影响及作用的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞购自中科院上海生命科学院细胞库。细胞置于含有20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养液中，放在37℃、5%CO2 孵箱中培养。

1.2 主要试剂和仪器

兔单抗BRD4抗体购自Abcam公司，ATRA、VPA均购自Sigma公司，；Western blotting 试剂（RIPA裂解液、PMSF、PVDF膜、显色液A和B、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、Prestained Protein Ladder、5×上样缓冲液、辣根过氧化物酶标记的二抗）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 三种诱导分化模型的建立

在对数生长期细胞中分别加入ATRA（0.5μmol/L）、VPA（1 mmol/L）、ATRA（0.5 μmol/L）联合VPA（1 mmol/L），分别于处理24、48、72 h后收获细胞，以状态良好，未加药的细胞作为对照组。

1.4 吉姆萨染色观察HL-60细胞分化

收集作用0、96 h细胞，1500 r/min离心5 min去上清，3 mL PBS洗涤3次后悬起，将细胞悬液涂在载玻片上，甲醇固定20 min，临用前用pH=6.3的磷酸缓冲液与吉姆萨原液以10︰1的比例混匀配成染液，将载玻片放入染色液中5 min，然后流水冲洗，干燥后镜下观察，摄片。

1.5 细胞分化检测

流式细胞术检测CD11b的表达：收集各组细胞（至少5×105个）作用0、72 h细胞，1500 r/min离心5 min去上清，3 mL PBS洗涤2次，用100μL PBS重悬细胞，室温孵育20 min。PBS洗2遍，用200μL PBS重悬细胞，上机检测。在FSC-SSC散点图上，设门于中性粒细胞区，分析CD11b的表达。

1.6 Western blot检测Brd4蛋白的表达

收集经ATRA（0.5μmol/L）、VPA（1 mmol/L） 、ATRA（0.5μmol/L）联合VPA（1mmol/L）诱导的不同时间段的HL-60细胞，用RIPA裂解液裂解，样品按照Bradford法蛋白定量，采用12%SDS-PAGE分离胶，每个样品都去30μg加入上样孔中，60 V，10 min；100 V，20 min；200 V，30 min电泳，300 mA恒流转膜45 min，封闭1 h后加入1︰800的BRD4抗体4℃孵育过夜，洗膜后加入1︰5000辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h后洗膜，ECL发光显色。

1.7 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，每个实验相同条件至少重复3次，均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Wright-Gimesa染色观察HL-60细胞分化现象

VPA与ATRA 联合对HL-60细胞的作用不仅表现为抑制细胞数量的增加，更主要的是诱导细胞形态的改变，使HL-60细胞向成熟粒细胞方向或者单核细胞方向分化。图1所示，Wright-Gimesa 染色结果如下：VPA 1 mmol/L+ ATRA 0.5μmol/L作用于HL-60细胞72 h后，形态学上的主要变化为细胞体积变小，染色呈浅蓝色的胞浆增多，嗜碱性染色变浅；深紫红色胞核明显缩小，出现明显的分叶现象，两叶、三叶或者多叶，核仁减少或消失；核浆比例减小。

2.2 ATRA与VPA联合对HL-60细胞分化的影响

两种药物均可介导HL-60细胞向粒系分化。CD11b是髓系细胞分化的表型标志。图2所示，两种药物均能提高HL-60细胞的分化能力（P<0.05），VPA 1 mmol/L+ ATRA 0.5 μmol/L联合对诱导HL-60分化的能力较单药用药组更为明显，CD11b表达更高（P<0.05）。

图2 ATRA和VPA联合作用HL-60细胞对其分化的影响

2.3 ATRA联合VPA诱导后HL-60细胞中BRD4的蛋白水平的表达

Western blot显示蛋白水平上，BRD4的变化趋势与mRNA水平变化相同，图3结果显示VPA 1mmol/L+ ATRA 0.5μmol/L诱导HL-60细胞72 h后，BRD4蛋白表达量显著下降（P<0.05），明显低于单药诱导组，这提示HL-60细胞诱导分化后BRD4的转录和翻译活动均被抑制。

3 讨论

BRD4在细胞内是一个多功能蛋白，它与不同的蛋白结合以发挥不同的功能，通过结合P-TEFb以及mediator，激活转录的延长过程；通过结合RFC，抑制DNA复制过程，并调节细胞G1/S期的转变；通过与spa-1结合，参与细胞信号传导途径，并调控细胞G2/M期的转变；BRD4还参与到某些病毒的生命周期中去，或者调控病毒基因的转录及复制，或者辅助病毒在细胞有丝分裂时均匀的分布到子代细胞中。所有的这些功能都是它结合乙酰化的染色质相联系的。在一种罕见的鳞状细胞癌中，BRD4作为一种原癌基因可以通过染色质移位出现突变[6]，但是这个突变在白血病中并没有发现有类似的作用。目前，研究证明BRD4是AML疾病维持所必须的重要因素，BRD4 shRNA在体内有越来越多的稳定的抗白血病作用，机制可能是通过myc转录通路起作用，myc作为BRD4潜在的下游靶点，所以BRD4在AML细胞中通过维持myc基因表达从而阻止髓系终末分化状态起作用，从而影响白血病细胞的自我更新[7-8]，但是具体机制仍未阐明。同时，最新研究表明，BRD4已经被作为多发性骨髓瘤（MM）、伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma）、中线细胞癌（NMC）、结肠癌、炎性疾病的一种治疗靶点；它抑制小鼠肿瘤转移，其表达是乳腺癌生存率的预后的标志；BRD4通过对转录因子等非组蛋白的乙酰化修饰而广泛参与到细胞周期调控、原癌基因调控、细胞分化、信号转导、某些病毒转录等过程，BRD4蛋白的改变通过对组蛋白乙酰化的失调控参与了白血病等恶性肿瘤的发生，其与肿瘤关系的研究将为肿瘤治疗提供新的策略[5，9-14]。

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