四神丸和葛根芩连片对结肠炎小鼠炎性细胞因子的影响

摘要：目的 探讨四神丸和葛根芩连片对硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的小鼠急性和慢性结肠炎细胞因子的影响。方法 小鼠自由饮用4%DSS连续5 d，制备急性结肠炎模型；小鼠4次循环饮用3%DSS制备慢性结肠炎模型。急性或慢性结肠炎实验小鼠均随机分为对照组、DSS急性或慢性模型组（模型组）、四神丸组、葛根芩连片组。急性模型小鼠于DSS饮水次日开始给药，连续8 d；慢性模型于DSS饮水2次循环后开始给药，连续16 d。ELISA检测各组小鼠结肠培养上清液中γ-干扰素（IFN-γ）、IL（白细胞介素）-17A及IL-22的含量。结果 急性结肠炎模型小鼠结肠培养上清液中IFN-γ、IL-17A及IL-22含量均明显增加（P<0.01），葛根芩连片能显著降低急性结肠模型小鼠IFN-γ、IL-17A的含量（P<0.05），四神丸则能显著降低IL-17A的含量（P<0.05）。慢性结肠炎模型小鼠结肠培养上清液中IFN-γ、IL-17A较对照组显著升高（P<0.01）；葛根芩连片及四神丸有降低二者的趋势。与对照组比较，四神丸可升高IL-22含量（P<0.05）。结论 葛根芩连片和四神丸通过降低急性结肠炎模型小鼠IFN-γ、IL-17A含量达到其治疗作用，四神丸通过促进IL-22升高发挥其治疗慢性结肠炎的作用。

关键词：四神丸；葛根芩连片；结肠炎；γ-干扰素；白细胞介素-17A；白细胞介素-22；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.020

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0071-04

Effects of Sishen Pill and Gegen Qinlian Tablet on Inflammatory Cytokines in Mice with Colitis WANG Xu-dan， GE Dong-yu， QIU Ze-ji， WU Ying， LI Gen-mao， HAO Yu （School of Basic Medical Science， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract：Objective To explore the effects of Sishen Pill and Gegen Qinlian Tablet on cytokines of acute and chronic colitis induced by dextran sulfate sodium （DSS） in mice. Methods Mice freely drank 4% DSS dissolved in drinking water for continuous 5 days to establish acute colitis model. Mice circularly drank 3% DSS for 4 times for the establishment of chronic colitis model. In the acute or chronic colitis experiment， mice were randomly divided into control group， acute and chronic model groups， Sishen Pill group， and Gegen Qinlian Tablet group. Acute model group was administrated one day after DSS drinking for 8 days. Chronic model group was administrated after the second time of circular drinking for 16 days. ELISA was used to detect the contents of IFN-γ， IL-17 and IL-22 in cultural supernatant of mouse colon. Results Contents of IFN-γ， IL-17A and IL-22 in cultural supernatant increased significantly in acute models （P<0.01）. Gegen Qinlian Tablet can significantly decrease the contents of IFN-γ and IL-17A of acute models （P<0.05）. Sishen Pill can significantly decrease the content of IL-17A （P<0.05）. IFN-γ and IL-17A in cultural supernatant in chronic model mice significantly increased compared with control group （P<0.01）. Sishen Pill and Gegen Qinlian Tablet inhibited the contents of IFN-γ and IL-17A. Compared with control group， Sishen Pill significantly increased the content of IL-22 （P<0.05）. Conclusion Sishen Pill and Gegen Qinlian Tablet can treat colitis by decreasing the contents of IFN-γ and IL-17A in acute colitis model mice；Sishen Pill can treat chronic colitis by promoting IL-22 to increase.

Key words：Sishen Pill；Gegen Qinlian Tablet；colitis；IFN-γ；IL-17A；IL-22；mice

基金项目：北京中医药大学科研基金（2013-JYBZZ-JS-119）

通讯作者：郝钰，E-mail：yuhao64@sina.com

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种常见的慢性胃肠道疾病，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗氏病（Crohn’s disease，CD）。本病以肠道炎症和黏膜组织损伤为特征，与肠道黏膜免疫反应异常有着密切的关系[1]。Th1细胞是导致肠黏膜炎症的主要效应细胞，此后发现Th17在黏膜炎症中也具有关键性作用[2]。硫酸葡聚糖钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的小鼠结肠炎是研究IBD常用的动物模型。IBD的中医辨证可分为多种证型，有报道认为，结肠炎早期多为大肠湿热证，而后期多表现为脾肾阳虚证[3]，大肠湿热证可用葛根芩连汤加减，脾肾阳虚证则可方用四神丸加味。我们前期研究发现，四神丸及葛根芩连片均对DSS诱导的小鼠急性结肠炎有显著的疗效，四神丸对DSS诱导的慢性结肠炎也有明显的疗效（待发表）。本研究观察四神丸及葛根芩连片对DSS诱导的急性及慢性结肠炎Th1分泌的γ-干扰素（IFN-γ）和Th17细胞分泌的IL（白细胞介素）-17A、IL-22的影响。

1 实验材料

1.1 动物

雌性C57BL/6J小鼠80只，8～10周龄，体质量18～22 g，SPF级，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0007。

1.2 药物

四神丸购于北京同仁堂天然药物有限公司，批号13080010；葛根芩连片购于太极集团四川绵阳制药有限公司，批号12120007。

1.3 主要试剂与仪器

DSS（分子量6500～10 000），Sigma-Aldrich，批号SLBB4215V；ConA，Sigma公司，批号71K7024；IL-17A和IL-22细胞因子ELISA试剂盒，Cusabio，批号S11033737、S24033738；IFN-γ细胞因子ELISA试剂盒，R&D，批号201309。5417R型高速冷冻离心机， Eppendof centrifuge；Calaxy S型CO2培养箱， RSBiotech公司；DNM型酶标仪，北京普朗新技术有限公司。

2 实验方法

2.1 造模

参考文献[4]方法，采用DSS诱导急性结肠炎模型。将DSS用蒸馏水配制成4%的溶液，令小鼠自由饮用，连续5 d。参考文献[5]方法，采用DSS诱导慢性结肠炎模型。将DSS用蒸馏水配制成3%的溶液，令小鼠自由饮用，时间为1-5 d、8-12 d、15-19 d、22-26 d，循环4次，2次循环之间予常水饮用。

2.2 分组与给药

实验小鼠随机分为对照组、模型组、四神丸组（2.25 g/kg，相当于临床人用量的10倍）、葛根芩连片组（6.5 g/kg，相当于临床人用量的10倍），每组10只。急性结肠炎实验：给予DSS后次日开始给药，每日次，连续8 d，第10日处死小鼠进行指标测定。慢性结肠炎实验：DSS饮水2次循环后开始给药（即实验开始后第12日），每日1次，连续16 d，给药后第17日（即实验开始后第29日）处死小鼠进行指标测定。

2.3 结肠组织培养上清液中细胞因子测定

结肠组织培养参考文献[6]。超净台内无菌取小鼠结肠，将结肠沿肠系膜纵向剖开，冷PBS溶液反复冲洗肠内容物。各组任取8只动物相同位置的结肠一段，约1 cm长，置24孔板中，加入1 mL完全RPMI 1640溶液（含青霉素、链霉素、1 μg/mL两性霉素B），置细胞培养箱中，37 ℃、5%CO2孵育24 h，高速离心后收集培养上清液。按ELISA试剂盒说明书测定结肠组织培养上清液中每毫克蛋白中IFN-γ、IL-17A和IL-22的含量。

2.4 肠系膜淋巴结细胞分泌的细胞因子测定

小鼠脱颈处死后，无菌取肠系膜淋巴结（MLN），分离成单个细胞悬液，用完全RPMI 1640培养液调整细胞浓度为2×106/mL，加入96孔培养板中，每孔100 μL，每孔再加入ConA（浓度为10 μg/mL，T细胞的丝裂原）100 μL。37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h，收集培养上清液。按ELISA试剂盒说明书测定结肠器官培养液中IFN-γ、IL-17A和IL-22的含量。

3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以 —x±s表示，组间比较采用方差分析，方差齐时，各组间两两比较采用LSD检验，方差不齐时，采用Tamhance"s T2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 模型小鼠和正常小鼠结肠组织和肠系膜淋巴结炎性细胞因子变化比较

通过检测结肠组织培养上清液和MLN中T细胞分泌的细胞因子变化发现：急性模型小鼠结肠培养上清液中IFN-γ较正常小鼠升高8.1倍，而MLN细胞培养上清液仅升高1.4倍，表明结肠中产生IFN-γ的Th1细胞比MLN中更为丰富；急性模型小鼠结肠培养上清液中IL-17A和IL-22分别较正常小鼠升高4.1倍和8.6倍，而MLN细胞培养上清液均只升高1.6倍，表明结肠中的Th17较MLN中丰富。结果见图1。DSS慢性结肠炎中，模型小鼠结肠培养上清液中IFN-γ为对照组的7.3倍，MLN则为对照组的2.4倍；结肠组织和MLN细胞培养上清液中IL-17A和IL-22变化差异较小；二者在结肠组织培养上清液中均升高1.8倍，在MLN细胞培养上清液中则升高1.5倍和1.9倍。

结肠组织

MLN

图1 模型组与对照组结肠组织与MLN细胞培养上清液中

炎性细胞因子比较

4.2 四神丸和葛根芩连片对急性结肠炎小鼠炎性细胞因子的影响

急性模型小鼠结肠培养上清液中IFN-γ、IL-17A及IL-22含量均明显增加（P<0.01），经四神丸和葛根芩连片治疗后，IFN-γ含量有所下降，葛根芩连片的降低作用更加明显，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）；结肠培养上清液中的IL-17A含量均显著下降（P<0.05）；但对IL-22含量均无明显变化。结果见表1。

表1 各组急性结肠炎小鼠结肠组织培养上清液中

炎性细胞因子水平比较（—x±s，pg/mg）

组别只数 IFN-γIL-17AIL-22

对照组87.1± 4.229.8±11.1174.4± 70.5

模型组857.5±25.9**123.7±52.4**1496.8±657.4**

四神丸组833.3±16.3*59.7±39.9△1640.3±705.9**

葛根芩连片组821.9± 9.9*△66.1±40.7△1211.3±737.2*

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05

4.3 四神丸和葛根芩连片对慢性结肠炎小鼠炎性细胞因子的影响

慢性模型小鼠结肠培养上清液中IFN-γ、IL-17A含量明显增加（P<0.01）。四神丸及葛根芩连片对慢性模型结肠上清液中IFN-γ有一定的降低趋势，与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）；二药对IL-17A影响也不明显，可能与IL-17A在结肠模型动物中升高并不明显有关。慢性模型组IL-22含量较对照组略有升高，葛根芩连片对IL-22无明显影响，但四神丸则使IL-22含量升高（P<0.05）。结果见表2。

表2 各组慢性结肠炎小鼠结肠组织培养上清液中

炎性细胞因子水平比较（—x±s，pg/mg）

组别只数IFN-γIL-17A IL-22

对照组89.8± 5.016.1± 5.0151.3± 79.7

模型组871.3±23.6**28.6±11.6**270.6±140.4

四神丸组844.9±19.9*21.1± 3.4334.5±134.0*

葛根芩连片组853.2±16.9**23.3± 8.6254.7±142.5

5 讨论

IBD是一种常见的慢性胃肠道疾病，是发生大肠直肠癌的主要风险因子。本病临床辨证可分为多种证型，大肠湿热证和脾肾阳虚证是其中较为常见的2种证型[7]，以葛根芩连汤和四神丸为基础方的方剂分别用于这两型IBD的治疗。有研究显示，四神丸及葛根芩连汤对大鼠溃疡性结肠炎有明显的疗效[8-9]。

DSS诱导的小鼠结肠炎是研究IBD常用模型之一，DSS可直接破坏结肠黏膜上皮并激发炎症[10]。研究显示，DSS模型小鼠黏膜组织中存在Th1细胞，Th1分泌IFN-γ诱导巨噬细胞活化并释放炎症因子，介导组织损伤。近年来发现，IBD患者及结肠炎模型动物的黏膜中还大量浸润另一T细胞亚群，即Th17[11]。Th17分泌多种细胞因子，包括IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22[12]。Th17在肠黏膜炎症中具有重要作用，正常生理状态下，肠黏膜即富含Th17细胞并分泌相关细胞因子，对维持肠黏膜稳定与控制共生微生物的适度免疫反应之间的平衡至关重要。IL-17A的主要作用是介导炎症、清除相关抗原，适度的IL-17A有免疫保护作用，如过量则介导免疫损伤。IL-22在肠黏膜炎症中具有保护作用，补充IL-22可促进DSS诱导的结肠炎的恢复，敲除IL-22基因可使小鼠对结肠炎易感[13]。因此，本实验中选择了以上3种细胞因子进行检测。

在选材上，我们比较了结肠组织培养上清液和MLN细胞培养上清液中细胞因子的变化情况，结果显示，2种取材部位的细胞因子变化趋势上基本一致。在急性模型结肠培养上清液中细胞因子的变化幅度更为明显。这一趋势表明，制备模型后肠黏膜组织中分泌细胞因子的效应细胞Th1及Th17更为丰富，而MLN中所增加的Th1和Th17数量较少。这一现象符合肠黏膜免疫反应的基本原理，即部分抗原提呈细胞捕获抗原后，引流到MLN，活化相应的T细胞；活化产生的效应T细胞（Th1和Th17）并不滞留在MLN，而是通过循环归巢到肠黏膜固有层，参与免疫应答。因此，富含效应T细胞的组织是肠黏膜（尤其是黏膜固有层）而不是MLN。因此，选择结肠组织培养上清液分析细胞因子的变化与T细胞介导的黏膜炎症反应的本质更为契合。

本研究结果显示，DSS诱导的急性结肠炎模型中IFN-γ、IL-17A和IL-22含量均显著升高，表明急性炎症黏膜组织中富含大量的Th1和Th17细胞。葛根芩连片能降低结肠培养上清液中IFN-γ，四神丸虽有降低的趋势，但差异无统计学意义。因此，葛根芩连片可通过抑制IFN-γ生成改善Th1介导的炎症反应。四神丸和葛根芩连片均能显著降低IL-17A的含量，二方之间则无明显的差异，表明二者可通过抑制IL-17A生成缓解Th17介导的炎症。此外，四神丸和葛根芩连片对Th17分泌的IL-22的影响与IL-17A并不一致。即葛根芩连片可使IL-22含量略有降低，而四神丸则能使IL-22含量略有升高，但与模型组比较差异均无统计学意义。导致这种差异的原因可能是四神丸对Th17产生IL-17A或IL-22有不同的影响，也有可能四神丸促进其他相关细胞分泌IL-22。

慢性结肠炎模型IFN-γ较对照组显著增加，且高于急性模型，表明Th1在慢性炎症形成过程中有累积效应。四神丸和葛根芩连片对IFN-γ有降低作用，但与模型组比较差异无统计学意义。慢性结肠炎模型动物IL-17A虽然显著高于对照组，但较急性结肠炎已明显降低；四神丸和葛根芩连片在慢性模型中对IL-17A的影响不大，可能与慢性模型中IL-17A升高并不显著有关。慢性结肠炎模型小鼠IL-22高于对照组，但差异无统计学意义，经四神丸治疗后，能进一步升高IL-22含量，葛根芩连片则无此作用。

综上所述，葛根芩连片和四神丸能显著抑制急性DSS结肠炎IFN-γ和IL-17A的生成，但对慢性结肠炎的IFN-γ和IL-17A无明显作用。此外，四神丸对急性及慢性结肠炎中IL-22的生成均有一定的促进作用。葛根芩连片和四神丸对急性结肠炎的治疗效应与其抑制炎性细胞因子IFN-γ和IL-17A有关；四神丸对慢性结肠炎的有效作用可能与其在一定程度上促进IL-22合成有关。是否存在其他效应尚需进一步研究。

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（收稿日期：2014-11-20）

（修回日期：2014-12-09；编辑：华强）

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