乳腺癌中Ulk1过表达与患者TNM分期和癌症复发的关系研究

检查;病理分期采用国际抗癌联盟（UICC）推荐的TNM分期，其中T1期94例、T2期42例、T3期36例、T4期24例;患者均自愿提供前乳腺癌组织标本，用作分析Ulk1蛋白的表达。患者（或患者直系亲属）均签署知情同意书。本研究已经医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 ELISA测定Ulk1蛋白水平 按照无菌条件操作，实验所有器具在使用前均用高压灭菌，烘干。将保存在-80 ℃冰箱中的乳腺癌组织取出解冻。称取0.1 g乳腺癌组织，加入少量液氮，在研钵中迅速将乳腺癌组织碾碎至粉末状;将组织粉末转入2 mL Eppendorf管中，加入1.2 mL PBS（pH 7.4），充分振荡混匀，4 ℃下2 000 r/min，离心20 min。仔细收集上清液。获取乳腺癌组织匀浆后，采用Elisa法检（试剂盒购于上海恒远生物科技有限公司）测乳腺癌组织中的Ulk1蛋白表达量。

1.2.2 Ulk1在T1～4期中的表达水平的测定 免疫组化方法测定Ulk1在T1～4期中的表达，制作常规5 μm乳腺癌组织石蜡切片，3% H2O2溶液常温阻断内源性过氧化氢酶活性，微波修复抗原，PBS常规冲洗，1% CXCR7抗体工作液（购于英国Abcam公司），4 ℃过夜，加入二抗（IgG），室温30 min，加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。采用双盲法统计结果，随机选取5个高倍视野（×400）计数，无色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分，同时计数;阳性细胞>50%为（+++），26%～50%为（++），6%～25%为（+），阳性细胞≤5%为（-），（-）及（+）归为阴性表达组，（++）及（+++）归为阳性表达组。

1.3 观察指标 检测并观察患者不同分期患者的Ulk1蛋白表达及阳性率，分析Ulk1蛋白表达与临床病理特征的关系，对患者进行随访，分析乳腺癌患者癌症复发的影响因素。

1.4 统计学处理 使用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验;复发因素分析采用logistic回归分析，检验水准α=0.05。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床病理特征组中Ulk1蛋白水平的表达 T1、T2、T3、T4期患者Ulk1蛋白水平分别为（2.67±0.19）、（1.83±0.09）、（1.25±0.25）、（0.75±0.18）ng/mL;T1期Ulk1蛋白表达高于T2、T3、T4期（t=20.200、24.102、46.121，P=0.000、0.000、0.000），T2期Ulk1蛋白表达高于T3、T4期（t=14.013、34.335，P=0.000、0.000），T3期Ulk1蛋白表达高于T4期（t=11.679，P=0.000）。

2.2 不同临床病理特征组中Ulk1阳性表达率比较 T1、T2、T3、T4期患者Ulk1阳性率分别为：94.7%（89/94）、85.7%（36/42）、61.1%（22/36）、37.5%（9/24）;T1、T2、T3、T4期患者Ulk1阳性率逐渐降低（字2=26.241，P=0.000），见图1。

2.3 Ulk1蛋白表达与临床病理特征的关系 Ulk1蛋白表达与年龄无关（P>0.05），分化程度越高、浸润深度越深、有淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移，Ulk1蛋白阳性表达率越低（P<0.05），见表1。

2.4 乳腺癌患者癌症复发因素分析 对所有患者均进行为期3年的随访，截至随访结束，乳腺癌患者癌症复发共64例。单因素分析结果显示，淋巴结转移、淋巴血管间隙浸润、Ulk1蛋白阳性与复发有关（P<0.05），见表2;以乳腺癌是否复发为因变量（无=0，有=1）进行多因素Logistics回归分析，结果显示：淋巴结转移、淋巴血管间隙浸润是乳腺癌患者复发的危险因素，Ulk1蛋白阳性是乳腺癌患者复发的保护因素（P<0.05），见表3。

3 讨论

肿瘤细胞诱导微血管生长及建立肿瘤中血液循环的过程是肿瘤发生、生长、浸润和转移的重要条件。近年来自噬作用与肿瘤血管生成之间的关系成为肿瘤学研究的热点。Ulk1在体外和体内模型中都能抑制血管生成，进而抑制癌细胞增殖和迁移[9-10]：通过敲除自噬相关基因7（ATG7）轻链可消除由ERY5介导的自噬，从而抑制血管生成。Ulk1能诱导自噬抑制新血管生成，进而抑制肿瘤进展，此外研究发现在肿瘤细胞中一些血管活性因子与Ulk1表达负相关[11-12]。

Ulk1蛋白在人胚胎组织中广泛表达，在正常的乳腺组织表达正常，乳腺癌患者Ulk1蛋白表达异常增高，而随着乳腺癌患者分期的进展，Ulk1蛋白表达逐渐降低，研究发现Ulk1蛋白对于乳腺癌的发生、发展具有重要的调控作用，其具有时间、空间表达特异性，若药物沉默Ulk1蛋白表达，肿瘤细胞的生长失去有效抑制，Ulk1蛋白可能成为肿瘤治疗的分子靶点。Ulk1可介导细胞的定向转移和趋化性，并激活淋巴细胞、内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞上相应的趋化因子受体[13-14]。研究表明，Ulk1蛋白在对启动细胞增殖发挥重要作用，并能强烈抑制细胞凋亡，Ulk1蛋白高度表达的乳腺癌细胞株增殖能力低于野生株。高表达Ulk1蛋白的肿瘤细胞黏附内皮细胞的能力低，而肿瘤细胞与内皮细胞紧密结合才能穿过细胞外基质层，建立转移灶[15-16]。研究还发现，IL-8、血管内皮生长因子（VEGF）有可能由UCAl调控，高表达Ulk1蛋白的肿瘤细胞可抑制IL-8、VEGF的分泌，而VEGF、IL-8在供应肿瘤生长的血管系统的形成及实体肿瘤的发展过程中发挥重要作用[17-20]。

本研究结果显示，T1期Ulk1蛋白表达高于T2、T3、T4期，T2期Ulk1蛋白表达高于T3、T4期，T3期Ulk1蛋白表达高于T4期，差异均有统计学意义（P<0.05）;T1、T2、T3、T4期患者Ulk1阳性率逐渐降低（P<0.05）;Ulk1蛋白表达与年龄无关（P>0.05），分化程度越高、浸润深度越深、有淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移，Ulk1蛋白阳性表达率越低（P<0.05）;Ulk1蛋白表达阳性是乳腺癌患者癌症复发的保护因素（OR=0.48，P<0.05）。提示Ulk1蛋白能抑制乳腺癌的发生进展过程，且与乳腺癌患者分期及复发成负相关关系。

综上所述，Ulk1蛋白在乳腺癌的发生进展过程中起抑制作用，TNM分期越高，Ulk1蛋白阳性率越低，Ulk1蛋白表达阳性是乳腺癌患者癌症复发的保护因素。

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（收稿日期：2019-02-14） （本文编辑：董悦）

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