水稻成花素家族OsDTH11基因的CRISPR/Cas9编辑突变体的创制

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摘    要：水稻成花素家族基因在水稻的开花结实过程中发挥重要作用。水稻基因组中共有19个成花素相关基因，其中Hd3a和RFT1基因已被证实能够促进水稻抽穗开花，其余成花素成员功能未知。本文针对水稻成花素家族成员OsDTH11基因，基于CRISPR/Cas9技术构建了基因编辑载体，并通过农杆菌介导的遗传转化方法成功获得了该基因的敲除突变体。经测序验证发现了2种类型的突变体，一种是纯合的62 bp缺失突变体，另一种是31 bp缺失的杂合突变体。通过自交分离分别获得两种类型稳定遗传的纯合突变体材料，为OsDTH11基因的生物学功能与水稻开花分子机制研究奠定了基础。

关键词：水稻;突变体;OsDTH11;CRISPR/Cas9

中图分类号：S511       文献标识码：A      DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.11.001

Abstract： The florigen family genes play an important role for the rice flowering. There are 19 members predicted in the rice genome. In these members， Hd3a and RFT1 were identified and characterized as florigen to promote rice flowering. The function of the rest of members remained unknown. In this study， we constructed the CRISPR/Cas9 editing vector of OsDTH11， a member of the florigen family gene， and introduced it into rice callus to produce the editing mutants by Agrobacterium-mediated transformation method. Further sequencing analysis confirmed that the obtained mutants had two types of mutation. One type of mutation was a homozygous 62 bp deletion in the editing mutant. The other was a heterozygous 31 bp deletion in the editing mutant. Finally， we obtained two kinds of homozygous mutants by self-fertilization， and these two kinds of mutation could stablely transmit to the next generation. These mutants laid a foundation for the functional study of OsDTH11 gene.

Key words： rice; mutant; OsDTH11; CRISPR/Cas9

水稻抽穗开花是水稻生产实践中的重要农艺性状，对水稻产量有着重要影响。目前研究表明，水稻的抽穗开花受多种基因表达调控通路的共同影响，其中成花素基因家族在这一过程中扮演重要角色。成花素基因编码的磷脂酰乙醇胺结合蛋白（Phosphatidyl ethanolamine-binding protein，PEBP），是一类可溶性的小分子球状蛋白，由中央较大的β-折叠和两侧较小的β-折叠及α-螺旋形成阴离子结合口袋，能够识别和结合磷酸化氨基酸残基，和磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyl ethanolamine）结合[1-2]。PEBP蛋白分布广泛，存在于从酵母到哺乳动物的多个物种中[3-5]。水稻基因组中共发现19个PEBP基因[1]，其中Hd3a及RFT1是两个功能明确的水稻成花素基因，可以促进水稻的抽穗[6]。成花素Hd3a及RFT1首先在叶片中表达，然后长距离转运到茎顶端分生组织后，在細胞质中与其受体14-3-3蛋白结合，再转入细胞核中与OsFD1转录因子结合形成成花素激活复合体（Florigen activation complex， FAC），诱导下游的花分生组织特异性基因OsMADS14及OsMADS15的表达，从而促进水稻的开花[6-7]。

创制突变体是基因功能研究的重要手段。传统的突变体创制方法主要通过理化诱变、T-DNA片段插入、转座子序列插入等方法。这些方法费时费功，不能定向产生某一确定基因的突变体材料。近年来，随着基因编辑技术的发展，对于基因组序列已知的物种，可针对某一特定的基因，创制相应的编辑突变体。目前基因编辑方法主要包括ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9，其中CRISPR/Cas9最为便捷高效[8]。CRISPR/Cas9的作用机制是由gRNA与Cas9蛋白组成复合体实现的，gRNA负责定位与其有互补关系的DNA双链，Cas9蛋白负责切割DNA双链产生双链断裂（Double strand breaking， DSB），经非同源末端连接修复后，导致碱基的插入或缺失突变。由于CRISPR/Cas9技术操作简单，效率较高，目前已被广泛地应用于各类生物中进行基因编辑。本研究采用CRISPR/Cas9技术对水稻成花素基因家族中未知功能基因OsDTH11（Date to heading 11， DTH11）进行敲除，产生功能缺失的突变体，并通过自交分离获得稳定遗传的纯合突变体材料。本研究结果为水稻成花素基因的功能研究提供物质基础，以期全面揭示水稻成花素基因家族在开花分子调控中扮演的角色。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究以粳稻品种中花11（Oryza sativa spp.japonica）为受体材料，经过农杆菌介导的遗传转化方法，产生CRISPR/Cas9编辑突变体材料。

1.2 CRISPR/Cas9靶位点设计

从水稻基因组数据库（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）获得OsDTH11基因组序列和编码序列。利用CRISPR/Cas9靶位点在线设计平台http：//skl.scau.edu.cn/[9]，设计靶位点。设计原则为：从目的基因的CDS序列中，查找符合GN19NGG的序列。其中GN19为20个碱基的靶点序列，NGG（N表示任意碱基）为识别靶序列的原初间隔序列毗邻基序（Protospacer adjacent motif， PAM）。优选靶位点位于编码序列5’端，GC含量大于50%，且与潜在脱靶位点的差异至少在3个碱基以上，以保证编辑的特异性，避免产生脱靶效应。

1.3 CRISPR/Cas9表达载体的构建

具体分为gRNA表达载体与CRISPR/Cas9-gRNA表达载体的构建两个步骤。第一步是构建gRNA的表达载体。（1）将靶点加上接头序列，合成两条24 nt的引物T-F和T-R。将引物T-F和引物T-R溶解，终浓度为10 μmol·L-1，各取10 μL加到PCR管，PCR仪中95 ℃孵育10 min，缓慢降至室温，获得寡聚二聚体。（2）用非典型Ⅱ型核糖核酸内切酶BbsⅠ切割空载体pOsU6SK，回收载体骨架。（3）将获得寡聚二聚体与回收的pOsU6SK载体骨架，用T4 DNA连接酶于16 ℃水浴锅中过夜连接。（4）将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，挑选单克隆进行PCR验证及测序分析，获得含有靶点的gRNA表达载体pOsU6SK-T1/T2。

第二步是构建最终能在植物中表达的双元载体。（1）用KpnⅠ和Hind III酶切第一步构建好的pOsU6SK-T1/T2质粒，回收gRNA表达盒;接着用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切含有Cas9片段的pCas9SK质粒，回收Cas9的表达盒;然后用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切pCAMBIA1300双元载体，回收载体骨架。（2）将回收的3个片段用T4 DNA连接酶于16 ℃水浴锅中过夜连接，经转化，挑选单克隆进行PCR验证及酶切验证，获得最终可以转化水稻的双元重组表达载体。

1.4 目的基因编辑突变体的获得与分子鉴定

将构建好的CRISPR/Cas9-gRNA表达载体电击转化至农杆菌菌株EHA105中，采用农杆菌介导的遗传转化方法转入水稻的愈伤组织中，获得转基因植株，具体操作方法参考Hiei等[10]论文中所述。将获得的转基因植株移栽至试验田中种植，植株复壮后采集单株叶片，用CTAB法提取基因组DNA作为模版，用载体中抗性标记基因潮霉素检测转基因植株，判断所构建的载体是否转入到水稻中。PCR扩增引物为Hyg-F（5’-GGAGCATATACGCCCGGAGT-3’）和Hyg-R（5’-GTTTATCGGCACTTTGCATCG-3’）。扩增条件为： 94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，运行30次循环;72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。

1.5 编辑突变体的突变位点测序分析

参照OsDTH11基因的基因组序列，分别在靶点的上下游约250 bp处设计一对检测引物，对包含了靶点的区段进行PCR扩增，分析目的基因OsDTH11的突变位点与类型。所用引物序列为OsDTH11-C-F（5’-GCACTGGAATGACGTAGCAC-3’）和OsDTH11-

C-R（5’-TAAGTACTCTCTCAACGTCG-3’），扩增条件为： 94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，运行30次循环;72 ℃延伸7 min。最后4 ℃保存。扩增产物先进行琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物质量及片段大小，然后将扩增产物进行测序。对出现编辑的测序结果，用双链解码工具http：//dsdecode.scgene.com或者http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/进行解码分析。对自交后代纯合突变体的鉴定采用相同的引物和方法进行。

2 结果与分析

2.1 靶位点的选择

水稻OsDTH11基因结构如图1所示。OsDTH11包含4个外显子和3个内含子，编码序列总长度为543 bp，编码180个氨基酸。根据靶点设计原则以及OsDTH11基因结构特点，在第1个外显子上设计了T1（5’-GTCGGCGAACAGCCTGGTGC-3’）和T2（5’-GTTCTCGCCGGAGGTGACGC-3’）2个靶点。通过BLAST比对分析显示，2个靶点特异性好，潜在脱靶率低。

2.2 目的基因CRISPR/Cas9表达载体的构建

CRISPR/Cas9在植物中的表达载体的骨架是pCAMBIA1300，表达载体需要装载gRNA与Cas9表达盒。首先将靶点序列T1和T2装载到gRNA的表达载体pOsU6SK上，用M13F和T-R引物对进行菌斑PCR扩增，得到372 bp的目的条带（图2A）;提取质粒后，用KpnⅠ和Hind III酶切验证，得到475 bp的gRNA表达盒（图2B），说明T1及T2靶点已成功装载到pOsU6SK载体中，后经测序证明两个靶点装载正确。

将上述构建的重组载体用KpnⅠ和Hind III酶切回收gRNA表达盒，再将Cas9的表达盒从p35S-Cas9-Nos-SK载体上用Hind III和EcoRⅠ双酶切回收，同时将植物双元载体pCAMBIA1300骨架用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切回收。將上述3个回收后片段用琼脂糖凝胶电泳检测（图2C），用T4 DNA连接酶将3个片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞得到最终的表达载体，挑取单克隆进行酶切验证，目的条带大小符合预期（图2D），表明带有靶点的gRNA及Cas9表达盒都成功连入植物双元载体pCAMBIA1300中，获得了最终的CRISPR/Cas9重组载体。

2.3 编辑突变体的获得和分子鉴定

将含有T1靶点的重组载体pCAMBIA1300-Cas9-T1和含有T2靶点的重组载体pCAMBAI1300-Cas9-T2，分别转入农杆菌菌株EHA105，侵染水稻品种中花11的愈伤组织。在含有潮霉素的筛选培养基上培养4周后，挑选生长紧实，颜色黄亮的愈伤颗粒移入分化培养基诱导分化。分化出的小苗经生根诱导后，得到T0代转基因植株。本研究共获得了T1靶点CRISPR/Cas9载体转化的17个独立株系的基因编辑植株，未知原因未获得T2靶点的基因编辑植株。提取17株基因编辑植株的基因组DNA作为PCR扩增模板，用潮霉素抗性筛选标记基因引物Hyg-F和Hyg-R进行PCR扩增检测。结果表明，获得的17株基因编辑植株均为潮霉素抗性基因阳性植株（图3）。

2.4 编辑突变体鉴定与测序分析

为了验证转基因阳性植株的靶位点是否发生了编辑突变，对所有的17株T0代转基因植株进行了靶位点测序分析，按预期设计，PCR扩增片段长度为605 bp。测序结果表明，17株T1靶点的转基因植株中有2株在靶点位置的序列发生了变异，将2株突变体分别命名为m1、m2。突变体m1在进行PCR扩增时，扩增产物长度比预期设计的片段小（图4A）。经测序分析为纯合大片段缺失，两条同源染色体均从T1靶点开始进行编辑，缺失了64 bp（图4A）。突变体m2经测序出现叠峰，经解码分析为杂合突变，一条同源染色体缺失31 bp片段，另一条同源染色体与野生型序列一致（图4B）。

为了验证T0代m1及m2突变体是否确为纯合突变体和杂合的突变体，并获得m2突变体的纯合编辑突变体，我们收获了T0代突变体的种子，种植在试验田中，获得了T1代的植株。对T1代单株测序检测表明：m1突变体T1代植株全部为大片段缺失突变，没有分离，可以稳定遗传，说明其的确为纯合突变体。m2突变体T1代植株经PCR检测后发现，发生了基因型分离。20株T1代植株中6株（2、5、10、13、15、17）为纯合31 bp缺失，6株（8、9、11、14、16、20）扩增出了预期的605 bp和574 bp的两条带，仍为杂合突变，其余8株为野生型植株，只扩增出了605 bp的目的条带（图4C），说明T0代m2突变体的确是杂合突变，通过自交分离出纯合的编辑突变体，而且可以稳定遗传到下一代。

进一步分析突变体在氨基酸序列上的变化，发现m1突变体缺少起始密码子，无法正常开始翻译蛋白质。m2纯合突变体由于缺失31 bp片段导致移码突变，翻译至第15个密码子时出现终止密码子，翻译提前终止。

综上，我们通过CRISPR/Cas9技术成功的敲除了成花素家族成员OsDTH11基因，产生了两种类型的突变体。两种类型的突变体都可能导致OsDTH11基因的功能缺失，为进一步研究OsDTH11基因的功能提供了材料。后续针对纯合突变体材料的表型分析将进一步揭示OsDTH11基因的生物学功能。

3 结论与讨论

PEBP家族广泛存在于拟南芥、水稻、小麦、玉米、杨树、番茄、大豆等高等植物中。对这些物种PEBP家族成员的氨基酸序列聚类分析，可以明显的分成FT-like、TFL-like和MFT-like三个亚家族[11]。这3个亚家族的功能已有了分化。如拟南芥的FT和TFL1、水稻的Hd3a及RCN、番茄的SP和SFT基因两两功能相反，分别为拟南芥、水稻及番茄的成花素和反成花素，促进或抑制植物开花[12-14]。最新的研究发现，过量表达OsFTL10可以增加水稻的耐旱性，表明PEBP家族存在花期调控以外的其他生长发育功能[15]，因而对其他成员的研究有着重要的意义。

为了解析OsDTH11的功能，本研究设计了T1和T2两个靶点，利用CRISPR/Cas9技术进行突变体的创制，共获得了T1靶点CRISPR/Cas9转化的17株T0代转基因植株。测序分析表明，有2个转基因植株的靶位点区段发生突变，突变率为12%，和以前报道的基因编辑效率相似。基因编辑的效率和类型，跟表达载体的效率、靶点的序列、靶基因在染色体上的位置、T-DNA整合到染色体上的位置等緊密相关。Ma等[17]研究表明，靶点序列与gRNA的骨架如果形成连续7个以上碱基对的互补，会严重影响打靶的效率。因此，不同的基因或选择的不同的靶点，编辑效率会有所不同。CRISPR/Cas9所导致的突变类型，一般是位于PAM前4～8 bp处发生数个碱基的缺失或插入，不同靶点的突变效率也有差异[16]，本研究中获得了两个不同大片段缺失类型，通过自交并进行测序分析发现这两个突变体都可以稳定遗传。本研究获得的两种基因编辑突变株均阻碍蛋白质的正常翻译，导致OsDTH11基因功能的丧失，为进一步揭示其生物学功能提供了可靠的突变体材料。

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