替格瑞洛对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞ICAM—1表达的影响

摘 要：目的 探究不同濃度的替格瑞洛对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞在蛋白及RNA水平表达细胞间黏附分子-1的影响。方法 离体培养人脐静脉内皮细胞，平均接种于6孔培养板，待细胞生长至融合状态时取三孔加入ox-LDL（50 μg/ml），再分别加入不同浓度的替格瑞洛（0、20、40 μmol/L）。刺激干预24 h后采用Western Blot法测定ICAM-1的蛋白表达水平。重复实验，采用Real-time PCR法测定ICAM-1的RNA表达水平。结果 ①oxLDL能明显上调ICAM-1的表达；②Western Blot蛋白定量结果显示，oxLDL诱导组ICAM-1的蛋白表达明显高于对应的非诱导组（P<0.05）；未予替格瑞洛干预组ICAM-1的蛋白表达高于替格瑞洛低浓度组（P<0.05）；替格瑞洛低浓度组ICAM-1的蛋白表达高于替格瑞洛高浓度组（P<0.05）；③Real-time PCR结果与Western Blot蛋白定量结果一致。结论 oxLDL能在RNA水平提高ICAM-1表达，替格瑞洛能在RNA水平抑制ICAM-1的表达，并与浓度正相关。

关键词：替格瑞洛；人脐静脉内皮细胞；氧化型低密度脂蛋白；细胞间黏附分子-1

中图分类号：R543 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.22.022

文章编号：1006-1959（2018）22-0081-04

Effect of Ticagrelor on the Expression of ICAM-1 in Human umbilical Vein Endothelial Cells Induced by oxLDL

LIU Hua1，2，KANG Mei-ni2，WANG Xing-hua2，LIANG Xue2，LI Guang-ping2

（1.Department of Cardiology，Cangzhou Central Hospital，Cangzhou 061000，Hebei，China；

2.Institute of Cardiology，Second Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China）

Abstract：Objective To investigate the effects of different concentrations of ticagrelor on the expression of intercellular adhesion molecule-1 in human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low density lipoprotein at protein and RNA levels.Methods Human umbilical vein endothelial cells were cultured in vitro and seeded on a 6-well culture plate. When the cells were grown to the fusion state， ox-LDL （50 μg/ml） was added to the wells， and different concentrations of ticagrelor were added（0， 20， 40 μmol/L）. The protein expression level of ICAM-1 was determined by Western Blot after 24 h of stimulation. The experiment was repeated and the RNA expression level of ICAM-1 was determined by Real-time PCR. Results ①oxLDL could up-regulate the expression of ICAM-1.②Western Blot protein quantitation results showed that the protein expression of ICAM-1 in oxLDL-induced group was significantly higher than that in the corresponding non-inducing group（P<0.05）；The protein expression of ICAM-1 in the Ticagrelor-free group was higher than that in the tigrisin group （P<0.05）. The protein expression of ICAM-1 in the low-concentration group was higher than that in the Ticagrelor group（P<0.05）； ③Real-time PCR results were consistent with Western Blot protein quantitation results. Conclusion oxLDL can increase the expression of ICAM-1 at the RNA level， and ticagrelor can inhibit the expression of ICAM-1 at the RNA level， and it is positively correlated with the concentration.

Key words：Ticagrelor；Human umbilical vein endothelial cells；Oxidized low density lipoprotein； Intercellular adhesion molecule-1

随着近年来信号传导和基因调控水平的研究，动脉粥样硬化发病机制愈发倾向于炎症损伤应答学说。粘附分子是炎症的始动因子和标志物，在动脉粥样硬化早期炎症中起着重要的作用。黏附分子-1（ICAM-1）是一种非常重要的具有代表性的粘附因子，在静息的内皮细胞上呈低水平表達或不表达，但在氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）等炎性损伤因子刺激下能迅速上调，导致白细胞停止滚动粘附于内皮细胞，导致一系列心血管病理改变。替格瑞洛（Tigeralor）作为新型抗血小板药物，在发挥抗血小板作用的同时，同时是否具有抗炎症损伤作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系 人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）CRL-1730由天津市心血管疾病研究所赠与，其培养基为含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM-F12。

1.1.2主要试剂 DMEM-12培养基（GIBC，美国）；oxLDL（北京欣源佳和生物科技有限公司，北京）；Tigeralor原粉（上海铂力生物科技有限公司，上海）；鼠抗ICAM-1单抗（北京中山金桥，北京）；鼠抗GAPDH单克隆IgG（Abcam，USA）；Page Rulert Prestained Protein Ladder（Fermentas，USA）；引物序列ICAM-1（Forward 5"-CCCTTCCCCCCAAAACTG-3" Rerverse 5"-GTCATTGTGAACACTGGCAGAAA-3"）β-actin（Forward 5"-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3"Reverse 5"-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3"）英淮捷基贸易有限公司设计合成。

1.1.2主要仪器 超净工作台（苏州净化设备有限公司，江苏）；Eppendorf低温离心机（eppendorf，德国）；细胞培养箱（Thermo Forma，USA）；6孔培养板（Corning，USA）；微量移液管（Brand accu-jet，USA）；紫外可见光分光光度计（Eppendrof，USA）；电子天平（北京多赛斯仪器系统有限公司，北京）；MilliQ超纯水系统（Milipore， 法国）；稳压稳流电泳仪（Becton，Dickinson and Company，USA）；电转膜仪（Becton，Dickinson and Company，USA）；水平摇床（Becton，Dickinson and Company，USA）；ABi7500实时定量PCR仪（ABI，美国）。

1.2方法

1.2.1 HUVECs细胞复苏与传代培养 从液氮罐取出冻存管，37 ℃水浴中融化后，离心弃上清；加入12 ml10%FBS，1%双抗的DMEM-F12培养液，混匀后移入细胞培养皿；观察细胞数量状态，将培养瓶放入37 ℃、5%CO2的培养箱内，次日待细胞贴壁后，换新鲜培养液继续培养。当镜下细胞密度达80%可进行细胞胰酶消化传代培养。传代培养2～3代后，将状态良好的细胞平均分装于6孔培养板，待6孔板细胞密度达70%细胞生长至融合状态时，进行刺激和干预。

1.2.2 oxLDL刺激与替格瑞洛干预 将替格瑞洛原粉5 mg溶解于100 μl DMSO中，用培养液按1：100稀释，得到浓度为1 μmol/ml的药物干预液。向6孔板内分别加入oxLDL及替格瑞洛，进行刺激和干预。分组如下：1组：培养液1 ml，替格瑞洛0；2组：培养液1 ml，替格瑞洛20 μl（20 μmol/ml）；3组：培养液1 ml，替格瑞洛40 μl（40 μmol/ml）；4组：培养液1 ml，oxLDL38ul（50 μg/ml），替格瑞洛0；5组：培养液1 ml，oxLDL38ul（50 μg/ml），替格瑞洛20 μl（20 μmol/ml）；6组：培养液1ml，oxLDL38 μl（50 μg/ml），替格瑞洛40 μl（40 μmol/ml）。其中1～3组为非oxLDL诱导组，4～6组为oxLDL诱导组。将6孔板置于37 ℃、5%CO2的培养箱内继续培养24 h。

1.2.3 Western Blot蛋白定量 分别提取各组蛋白，采用Western Blot进行蛋白定量，经制胶、电泳、转膜、封闭、孵育、曝光后取得胶片。胶片用LabWorksTM凝胶成像及分析系统对目的条带和GAPDH（持家基因内参）条带进行摄像，测量条带的灰度值；比较各组校准后蛋白条带灰度值的关系，并以未经刺激干预组为其标准值，计算各组条带相对灰度值并绘制柱状图。

1.2.4实时定量PCR 分别提取RNA，先反转录DNA，再以Real-time PCR法进行RNA定量测定。引物序列：ICAM-1 Forward：5"-CCCTTCCCCCCAAAACTG-3" Rerverse：5"-GTCATTGTGAACACTGGCAGAAA-3"；β-actin Forward：5"-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3" Reverse：5"-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3"。Real-time PCR反应40个循环后，自带软件自动进行数据分析并绘制柱状图：Folds=2-ΔΔCt；ΔΔCt=（Ct1-Ct2）-（Ct3-Ct4）；Ct1=处理样品待测基因的临界循环数；Ct2=处理样品持家基因β-actin的临界循环数；Ct3=对照样品待测基因的临界循环数；Ct4=对照样品持家基因β-actin的临界循环数。

1.3统计学统计 重复试验，采用SPSS16.0软件，计量资料以（x±s）表示，多组样本平均数的比较采用采用举因素方差分析（one-wayANOVA），两两比较采用LSD-t法，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western Blot蛋白定量结果 oxLDL诱导组ICAM-1的蛋白表达高于对应的非诱导组（P<0.05）；未予替格瑞洛干预组ICAM-1的蛋白表达替格瑞洛低浓度组（P<0.05）；替格瑞洛低浓度组ICAM-1的蛋白表达高于替格瑞洛高浓度组（P<0.05），见表1、图1。

2.2 Real-time PCR结果 oxLDL诱导组ICAM-1的蛋白表达高于对应的非诱导组；未予替格瑞洛干预组ICAM-1的蛋白表达替格瑞洛低浓度组；替格瑞洛低浓度组ICAM-1的蛋白表达替格瑞洛高浓度组。结果与WesternBlot蛋白定量一致，见图2、表2。

3讨论

随着近年来信号传导和基因调控水平的研究，动脉粥样硬化发病机制愈发倾向于炎症损伤应答学说。粘附分子是炎症的始动因子和标志物，在动脉粥样硬化早期炎症中起着重要的作用，是多种血管损伤途径的共同通路[1-3]。ICAM-1作为重要的粘附因子，在血管内皮细胞表达最高，其次为外周白细胞。在静息内皮细胞上呈低水平表达或不表达，在TNF-α、oxLDL、IL等炎性损伤因子刺激下迅速上调[4]。ICAM-1与P-selectin、E-selecin作用后，与整合素家族CD11a/CD18高亲和相互作用，导致白细胞停止滚动，稳定粘附于内皮细胞。血管内皮、心肌细胞与白细胞相互激活，产生和释放氧自由基和血管活性物质等因子，形成炎症瀑布，导致血管损伤，产生一系列病理改变[5]。心血管药物的抗炎症损伤作用一直是研究热点。既往研究表明，许多心血管药物在发挥其他药物作用的同时还有抗炎症损伤作用。替格瑞洛不需要代谢活化便可拮抗 ADP介导血小板聚集作用，起效更迅速[6]，可以改善ACS和PCI治疗的疗效，以及限制死亡率和心血管事件的发生率[7，8]。此外，替格瑞洛属于碳环核苷类药物，它还通过增加血液中腺苷浓度使心血管患者受益[9]。

本研究显示，oxLDL能在RNA水平提高ICAM-1表达；替格瑞洛能在RNA水平抑制ICAM-1的表达，并与浓度正相关。替格瑞洛能够在RNA水平下调ICAM-1因子，进而减少血管内皮与白细胞的粘附作用，减少血管内皮损伤改善患者预后，与其他相关研究相符合[10]。替格瑞洛药物多效性可能会为心血管系统疾病的预防治疗提供新的思路。

综上所述，替格瑞洛在发挥抗血小板作用的同时，还能够在RNA水平抑制粘附因子ICAM-1的表达，具有抗炎症损伤的作用，进而减少血管内皮损伤改善患者预后。

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[10]Kubisa MJ，Jezewski MP，Gasecka A，et al.Ticagrelor toward more efficient platelet inhibition and beyond[J].Ther Clin Risk Manag，2018（14）：129-140.

收稿日期：2018-7-1；修回日期：2018-8-1

編辑/雷华

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