酸法和酶法提取罗非鱼鱼皮胶原蛋白特性分析

材料，利用醋酸和胃蛋白酶分提取胶原蛋白，通过紫外光谱、红外光谱、吸油性、保水性、溶解性等对其理化特性进行比较分析.结果表明两者在230nm左右出现最大紫外吸收峰，均属典型的胶原蛋白;红外显示两种蛋白结构相似;酶溶性胶原蛋白吸油性优于酸溶性胶原蛋白，且两者都有很好的保水性和溶解性.以期为胶原蛋白的提取及应用提供理论依据.

关键词：罗非鱼;提取;胶原蛋白;特性

中图分类号：TS201.2  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2019）09-0090-03

罗非鱼是世界第三大养殖品种，在我国养殖量居第二[1].目前，其主要用来生产冷冻鱼肉片，因此会留下60%～70%下脚料，包括鱼皮、鱼头、鱼鳍和鱼骨，其中鱼皮中含有丰富的胶原蛋白[3]，对其进行有效利用，避免浪费的同时还可减少环境污染[2].

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白质，它构成了动物皮的支持组织，具有增强机体皮肤组织细胞储水能力、增强肌肤弹性、保持皮肤柔软、使皮肤细嫩等生理功能，其理化性质和生物学特性优良，在医学、食品工业和化妆品等领域应用广泛.胶原蛋白的提取分离方法包括热水提法、酸提法、酶提法等[4].

醋酸酸法和胃蛋白酶酶法提取胶原蛋白，通过紫外光谱、红外光谱以及吸油性、保水性、溶解性测定对两者理化特性进行分析比较，以期为胶原蛋白的提取及应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

罗非鱼鱼皮产自江苏连云港飞凡水产公司;羟脯氨酸购于Sigma公司;氯化钠、异丙醇、胃蛋白酶、正丙醇、无水乙酸钠、乙酸、硫酸铜、柠檬酸购于上海国药，均为分析纯.

1.2 试验仪器

SC-3612离心机（江苏金坛市荣华仪器制造有限公司）、ST3100酸度计（奥豪斯仪器有限公司）、SP-723分光光度计（光谱仪器有限公司）、Nicolet IS50傅立叶变换红外光谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）等.

1.3 试验方法

1.3.1 鱼皮预处理

将鱼皮烘干，粉碎，5%氯化钠浸泡6h，蒸馏水洗涤数次并沥干水分，置于异丙醇、乙醚与蒸馏水体积比为2：2：8的溶液中浸泡6h，蒸馏水洗涤数次后沥干水分并在55℃恒温干燥箱中烘干备用[5].

1.3.2 酸溶性胶原蛋白（ASC）的制备

按料液比1：20加入预处理所得鱼皮和0.5mol/L乙酸，磁力搅拌24小时，离心得到上清，加入氯化钠使得浓度至0.9mol/L，静置过夜.6000r/min离心20min，舍弃上清，沉淀加入10倍体积0.1mol/L的乙酸进行溶解，并在10倍体积的0.1mol/L乙酸溶液中透析12h，每4h换一次透析液，蒸馏水透析至中性，得到酸溶性胶原蛋白提取液，冷冻干燥得到酸溶性胶原蛋白（ASC）[6].

1.3.3 酶溶性胶原蛋白（PSC）的制备

将预处理后的鱼皮按料液比1：20加入0.5mol/L乙酸中，并加入鱼皮质量2%的胃蛋白酶.磁力搅拌提取24h，离心取上清，加入一定质量的氯化钠至上清液氯化钠溶液最终浓度为0.9mol/L，靜置过夜.6000r/min离心20min，弃上清，加入10倍体积的0.1mol/L的乙酸中溶解沉淀，并在10倍体积的0.1mol/L乙酸溶液中透析12h，每4h换一次透析液，蒸馏水透析至中性，得到酶溶性胶原蛋白提取液，冷冻干燥得到酶溶性胶原蛋白（PSC）[6].

1.3.4 胶原蛋白得率计算

胶原蛋白得率/%=（冻干胶原蛋白粗品质量/提取用鱼皮质量）×100（1）

1.3.5 紫外吸收光谱分析

将酸溶性胶原蛋白提取液和酶溶性胶原蛋白提取液，以0.5mol/L的醋酸作为对照，在200～400nm波长范围内用紫外可见分光光度计测定其吸光度，得到胶原蛋白紫外吸收曲线[7].

1.3.6 红外光谱分析

采用傅里叶红光谱仪对ASC和PSC进行红外扫描，分别将适量的ASC和PSC与KBr混合压片，在400～4000cm-1波数区间扫描，分辨率4cm-1[8，16].

1.3.7 溶解性测定

取一定质量ASC、PSC溶于0.5mol/L醋酸中，使得浓度为5mg/mL.取5mL分别调至pH为4、5、6、7、8、9，保持pH值不变，蒸馏水定容至10mL，4000r/min离心15min，双缩脲法测定上清液蛋白质含量，并同时将样品溶于0.5mol/L醋酸溶液采用双缩脲法测定样品总蛋白含量，用公式（2）计算溶解性[7].

溶解性%=（上清液蛋白质量/总蛋白质量）×100 （2）

1.3.8 吸油性测定

取两份10mL精炼油，分别加入0.1g ASC和PSC，振荡器震荡1min，静置半小时，于200r/min离心25min，按公式（3）计算吸油性[7].

X=（10.0-v_f）/m   （3）

式中：X为吸油性/（mL/g）;Vf为游离油的体积/mL;m为0.1g.

1.3.9 保水性测定

量取50mL蒸馏水，加入ASC和PSC 0.05g，搅拌，置于1000r/min条件下离心5min，弃分离水，称量残留物质量，并置于25℃干燥箱中，每隔20min测一次质量，按公式（4）计算水分残存率[7]，以其衡量两者保水性强弱.

Y%=（m₀-m/m₀-0.05）×100  （4）

式中：Y表示水分残存率%;m0表示离心剩余物质量/g;m表示每隔一段时间剩余物质量/g.

2 结果与分析

2.1 不同提取液胶原蛋白得率

在酸性条件下，蛋白质分子之间离子键遭到破坏，发生胶原纤维膨胀、溶解现象，因而可利用酸法提取胶原蛋白;酶法提取是利用蛋白酶使胶原溶解[9].由图1可得，酶法提取胶原蛋白得率较酸法提取高，且提高近2倍.

2.2 紫外吸收光谱分析

对酸溶性胶原蛋白提取液和酶溶性胶原蛋白提取液在紫外光区进行全波长扫描测试，得到的紫外扫描曲线如图2所示，由于胶原蛋白共轭氨基酸含量较少，在280nm波长处无吸收峰，而在225nm左右有最大吸收峰，试验结果符合胶原蛋白的吸收特征[10]，且杂峰较少，表明提取胶原蛋白纯度较高.

2.3 红外光谱分析

如图3所示，ASC和PSC产生的吸收峰形状和位置基本一致，在4000～3000cm-1范围内，ASC和PSC均有一个较宽的峰，分别在3450cm-1和3440cm-1处，是由酰胺A带所产生[11];PSC在2000～1000cm-1波数内出现三个强而窄的吸收峰，其中1640cm-1处吸收峰是由胶原蛋白酰胺I带产生，在1550cm-1（ASC）和1560cm-1（PSC）处的吸收峰是由胶原蛋白酰胺II带产生，1390cm-1处为酰胺III带吸收峰，综上表明PSC和ASC主体结构均保留比较完整.

2.4 溶解性

溶解度指物质在特定溶剂中溶解的最大限度，其在天然蛋白质提取、分离和纯化时起到重要作用，蛋白质变性程度也可通过蛋白质的溶解行为的变化作为评价指标，此外蛋白质在饮料中的应用也与其溶解性能有直接的关系[12].

如图4所示，随着pH值的上升，PSC和ASC的溶解性先快速下降又逐渐趋于平缓.pH=4时PSC和ASC的溶解性最好，ASC可达80%，PSC达63%，而pH在7～9时胶原蛋白的溶解性较差，在30%左右.胶原蛋白溶解性随pH的变化跟其等电点位置有关，当处于等电点，两性离子达到电荷平衡，溶解度达到最低[13-14]，因此结果表明罗非鱼鱼皮胶原蛋白等电点位于7附近.

2.5吸油性

图5可见，ASC和PSC的吸油能力约为30mL/g和49mL/g.PSC的吸油性更佳，可能与胃蛋白酶作用于酶切位点使得较多疏水基团暴露，使得酶溶性胶原蛋白吸油能力增加，且研究表明，蛋白质吸油性跟其结构密切相关[15].

2.6 保水性

保水性指当蛋白质受到外力作用时其保持水分的能力，受浓度、离子种类以及环境等影响[7].ASC和PSC在25℃条件下随时间改变保水性的变化如图6所示，水分残存率随时间增加逐渐下降，但ASC保水性较PSC下降缓慢，可能由于醋酸和胃蛋白酶对亲水基团的作用差异，使得暴露的亲水基团不同360min后，ASC和PSC的水残存率仍然在90%作用，保水性均优良.

3 结论与讨论

酸法和酶法提取罗非鱼鱼皮胶原蛋白并比较其理化性质，两种方法提取得到的胶原蛋白主体结构基本一致，均保留较完整;但从得率、溶解性和吸油性的角度，酶法提取得到的胶原蛋白更优，而酸法提取的胶原蛋白保水性较好，因此，醋酸法和胃蛋白酶法提取的胶原蛋白可应用于不同的领域.

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参考文献：

〔1〕巩育军，郭先霞，李瑞伟，等.罗非鱼营养成分研究进展[J].中国食物与营养，2009（11）：50-52.

〔2〕Zheng S K， Zheng C H， Lin H， et al. Isolation and cliaracterization of acid-solubilised collagen from the skin of Nile tilapia （Oreochromis niloticus） [J]. Food Chemistry， 2009， 116：879-883.

〔3〕倪娜.羊血漿蛋白-肌原纤维蛋白复合凝胶形成的作用力分析[D].中国农业科学院，2014.27-30.

〔4〕郅慧，于慧，张辉，等.动物源胶原蛋白提取及应用研究进展[J].吉林中医药，2019，39（02）：225-227.

〔5〕田宏，张春华，陈山乔，等.罗非鱼头磷脂组成及其化学特性[J].赤峰学院学报（自然科学版），2016，32（24）：11-14.

〔6〕王晓军，吴婷，贾伟，等.酸法和酶法提取牦牛骨胶原蛋白的特性分析[J].食品科学，2018，39（12）：101-106.

〔7〕包玉龙，陈孙福，罗永康.酸法和酶法提取鳄鱼皮胶原蛋白及性质研究[J].肉类研究，2012，26（07）：1-4.

〔8〕Z·elechowska E， Sadowska M， Turk M. Isolation and some properties of collagen from the backbone of Baltic cod （Gadus morhua）[J]. Food Hydrocolloids， 2010， 24（4）： 325-329.

〔9〕张敏.酸法和酶法提取齐口裂腹鱼皮胶原蛋白及鉴定性质研究[D].四川农业大学，2014.

〔10〕辛菲.鲅鱼皮胶原蛋白的提取及分子特性的初步研究[D].新疆农业大学，2012.

〔11〕黄石溪，陈桂平，罗灿，等.酸法和酶法提取鮰鱼皮胶原蛋白的工艺研究[J].农产品加工（学刊），2013（16）：51-54.

〔12〕Zhenying H， Liang Q， Yong S， et al. Improvement of the solubility and emulsifying properties of rice bran protein by phosphorylation with sodium trimetaphosphate[J]. Food Hydrocolloids， 2019（96）：288-299.

〔13〕王碧，贾冬英，罗红平，等.皮边角废料提取胶原蛋白的功能特性[J].中国皮革，2002（15）：13-16.

〔14〕肖桂华，朱蓓薇，董秀萍，等.鲍鱼腹足不同部位的质构特性及组织结构研究[J].食品科技，2010，35（11）：155-159.

〔15〕孙冰玉，石彦国.微波对醇提大豆浓缩蛋白吸油性的影响[J].中国食品学报，2006（05）：97-100.

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