丙泊酚在正颌外科控制性降压中的脑保护作用机理

[摘要]目的：通过大鼠实验，研究丙泊酚在大鼠脑缺血再灌注损伤时对线粒体通透性转换孔活性的影响程度，及其抑制神经细胞凋亡坏死的作用机制。以探讨其在正颌外科控制性降压中的脑保护作用机理。方法：选取健康雄性大鼠30只，体重250～300g，采用“双侧颈总动脉阻断法”建立前脑缺血再灌注模型，左侧侧脑室于假手术组（C组）、缺血再灌注组（I/R）组注射生理盐水1ml/kg，丙泊酚干预组（P组）射注丙泊酚1mg/kg，24h后断头提取海马组织线粒体，加入CaCl2于37℃下形成钙超载后孵育5min。电镜观察其微观组织形态学改变，采用紫外分光光度计法来观察线粒体通透性转换孔开放程度。结果：电镜下C组线粒体结构完整，排列密集；I/R组可见线粒体明显肿胀、嵴断裂、膜破裂；P组可见线粒体部分肿胀，嵴部分断裂，但损伤程度轻于I/R组。与C组相比较，I/R组和P组线粒体吸光度值明显下降（P<0.05）；与I/R相比，P吸光度值下降幅度减小（P<0.05）。丙泊酚组细胞肿胀坏死明显减轻，凋亡细胞及坏死细胞明显减少。结论：丙泊酚能够改善大鼠前脑缺血再灌注后线粒体形态，其机制可能与其抑制线粒体通透性转换孔（MPTP）开放有关，从而改善线粒体功能，抑制神经细胞凋亡坏死，减轻脑缺血再灌注损伤。这说明丙泊酚在正颌外科控制性降压中使用时对大脑有良好的保护作用，可以大幅度提高手术安全效果，具有重要的临床指导意义。

[关键词]丙泊酚；脑缺血/再灌注；线粒体通透性转换孔

[中图分类号]R971+.2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）10-1072-04

脑缺血再灌注所造成的神经细胞损伤是各种脑血管疾病所带来的主要病例生理改变。脑缺血/再灌注后神经细胞能量代谢失衡，钙超载和自由基生成会导致线粒体通透性转换孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore， MPTP）的开放，引起线粒体功能障碍，最终促使神经细胞死亡和神经细胞凋亡的发生[1]。丙泊酚能够抑制大鼠脑缺血再灌注后氧自由基生成和钙超载，从而发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用[2]。本实验拟观察丙泊酚对大鼠前脑缺血再灌注后MPTP的影响，进一步探讨丙泊酚在正颌外科控制性降压中使用时脑保护的作用机制。

1 材料和方法

1.1 研究对象：健康雄性Wistar大鼠30只，体重250～300g，随机分为3组（n=10）。假手术组（C）：暴露双侧颈总动脉后，左侧脑室注射生理盐水1mg/kg；缺血再灌注组（I/R）：脑缺血后左侧脑室注射生理盐水1mg/kg；异丙酚干预组（P）：脑缺血后左侧脑室注射异丙酚1mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 采用“双侧颈总动脉阻断法”建立前脑缺血再灌注模型。4%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉后，行大鼠股动脉穿刺，置管，监测大鼠平均动脉压。放血降压至平均动脉压为（40±5）mmHg时，颈正中切口，暴露双侧颈总动脉，夹闭双侧劲总动脉10min后放开动脉夹形成再灌注。分别于缺血前，缺血后，再灌注后以及动物复苏后各时间点测量动脉血气。

1.2.2 将大鼠麻醉后，迅速固定于脑立体定位仪上，头皮正中切口，全部采用左侧侧脑室注射，于前囟后1mm，向左侧1.2～1.5mm处，微量注射器沿此定位孔插入3.5～4.0mm，回吸脑脊液通畅，将生理盐水或丙泊酚注射到侧脑室中，消毒缝合切口。

1.2.3 每组10只大鼠于再灌注24h后断头，冰台上迅速分离两侧海马组织，PBS缓冲液冲洗，匀浆后置于分离缓冲液中。线粒体的提取依Pierce试剂盒（Phermo公司，美国）说明进行。将线粒体重悬于1ml重悬液中，取适量测蛋白含量，线粒体的含量以所含蛋白量表示，依BCA蛋白浓度测定试剂盒测定。取各组海马组织的C1区固定于含0.1 mol/L二甲砷酸盐缓冲液的4%戊二醛（pH 7.4）和1%的四氧化锇中固定。经乙醇梯度脱水后，包埋于Epon 812 环氧树脂中，80 nm 超薄切片，以醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色，透射电子显微镜观察海马组织C1区神经元超微结构的改变。紫外分光光度计法测定MPTP的开放状态。

1.2.4 将提取后的各组线粒体即刻置于300mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris·HCl的重悬液中充分混匀。各组加入200μmol/L的CaCl2。整个反应体积为2ml，反应温度为37℃，即刻测定540 nm波长下5 min 内各组线粒体吸光度值的变化。以吸光度值的变化表示MPTP的开放程度，从而反应MPTP的活性。

1.3 统计方法：采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学处理，各组计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间及组内比较均用完全随机设计资料的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生理指标：动物在实验过程中各时间点的血气分析结果，组间差异无统计学意义（P>0.05），因此，能够排除血气因素对本实验的影响，见表1。C组大鼠脑电图形态为短至长程8～10Hz、20～120μV的α节律和低电压β波，间有单个θ波，见图1；I/R组大鼠脑电图形态为波幅较低的持续性7Hz、30～40μV的θ节律，见图2，证实大鼠脑缺血模型成功。

2.2 线粒体形态学改变：C组可见线粒体内膜结构完整，内嵴清晰，排列密集；I/R组可见线粒体显著肿胀，嵴呈絮状，断裂，排列错乱，基质电子密度低；P组可见线粒体部分肿胀，嵴部分断裂，损伤程度介于C组和I/R组之间，见图3～5。

2.3 线粒体通透性转换孔活性：表2所示在加入CaCl2后，三组的线粒体吸光度下降值。与C组相比，I/R组和P组吸光度值均下降（P<0.05），其中， I/R组的吸光度值下降最显著（P<0.05）。

3 讨论

线粒体是细胞能量代谢的中心，脑缺血再灌注时，自由基损伤是引起脑缺血再灌注损伤极为重要的环节[3]，自由基是具有不配对电子的原子或原子团的总称。自由基一旦产生过量就可引起脂质、蛋白质和核酸的过氧化反应，使膜结构遭到破坏、蛋白质降解、核酸链断裂、细胞崩解、线粒体变性，从而导致细胞的不可逆性改变，最终死亡。同时细胞内的Ca2+浓度的变化，也是诸多生理和病理变化的重要中介因素。脑缺血缺氧时，由于ATP供应不足，大量兴奋性氨基酸受体过度兴奋介导与其偶联的钙通道开放、膜通透性增大及封阻机制障碍而致细胞外钙内流增加、造成细胞内Ca2+浓度增高。而细胞内Ca2+超载，一方面使血管收缩、进一步加重脑缺血缺氧；同时引起细胞代谢紊乱、结构和功能发生异常改变，导致线粒体膜间隙肿胀，通透性降低，线粒体吸光度值下降及形态发生改变；线粒体受到严重破坏，能量生成障碍，线粒体通透性转换孔发生变化，引起神经细胞凋亡[4]。通过本实验发现，缺血再灌注（I/R）组神经细胞线粒体肿胀甚至破裂，基质大量破坏，证明缺血再灌注损伤会导致线粒体形态发生改变。线粒体内钙离子聚集引起线粒体膜电位消失，而线粒体膜电位同线粒体通透性转换孔（MPTP）密切相关[5]。MPTP是位于线粒体内外膜之间，非选择性的多蛋白复合体，由电压依赖型的阴离子通道、腺嘌呤核苷酸转运体、亲环蛋白D和其它蛋白组成[6]。缺血再灌注时，氧自由基和钙超载会诱发MPTP开放，促使线粒体内前凋亡因子细胞色素C等释放到胞浆中，激活依赖caspase及非依赖caspase凋亡途径，引起神经元凋亡[7]。同时促使大量离子非选择性进入线粒体，造成线粒体膜电位丧失，线粒体肿胀[8]。我们通过对钙离子诱发缺血后线粒体损伤研究发现，I/R组线粒体在540nm下的吸光度值明显下降，表明钙离子诱导MPTP开放，促使线粒体通透性增高。

丙泊酚能够抑制脑缺血再灌注后的钙超载和自由基生成，发挥脑保护作用[9]。研究发现丙泊酚具有抗自由基、抑制脂质过氧化反应的作用。丙泊酚的化学结构为2，6-二异丙基苯酚，是一种含有酚环结构的脂溶性化合物，与已知的抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚和内源性抗氧化剂维生素E在化学结构上有类似之处。在自由基反应体系中，酚结构可以提供一个氢原子，自身转变成为苯氧基团，其中芳香环的共轭效应使得苯氧基团活性降低，不能激发脂质过氧化反应发生，而过多的自由基对机体的损伤主要是由脂质过氧化反应造成的。丙泊酚可以直接与氧自由基反应，生成稳定的2，6-二异丙基苯氧基团，即以低活性的自由基取代了高活性的自由基，减轻了后者引发的脂质过氧化反应。贾东林等[10]在大鼠脑皮质线粒体自由基损伤模型中，发现过氧化反应可降低线粒体膜流动性、增加线粒体肿胀和丙二醛含量，而预先给予丙泊酚30μmol/L体外温育则可减轻上述损伤。本研究通过电子显微镜观察经丙泊酚干预后的神经细胞，发现其线粒体形态保持较好，这证明了丙泊酚能够维持线粒体膜电位水平，并减轻线粒体肿胀，改善线粒体功能。丙泊酚发挥脑保护作用的另一机制可能是抑制细胞内的钙超载。目前认为钙介导的毒性作用是脑细胞死亡的重要因素。各种原因引起的细胞内钙超载是启动一系列病理生理机制导致神经细胞死亡和凋亡的最后共同通路。细胞内钙浓度往往和脑损伤时细胞受损程度呈正相关。丙泊酚可在一定程度上增加L型电压依赖性钙通道的电流失活率，从而减少钙内流。丙泊酚还可通过抑制磷脂酶C的活性减少三磷酸肌醇的合成，降低了细胞内储存钙的释放量，减轻细胞内钙超载[11]。观察丙泊酚对钙诱导所致线粒体损伤的影响，结果发现丙泊酚干预后线粒体吸光度值较缺血组下降缓慢，提示丙泊酚阻止钙超载引起的MPTP孔道开放，维持线粒体膜电位稳定，直接发挥轻度解偶联的作用。

正颌外科控制性降压是必须使用的一项麻醉技术，丙泊酚是术中常用的麻醉药，由于丙泊酚有类似巴比妥类药物的作用，包括减轻脑水肿，降低脑代谢率，减少神经细胞能量消耗；此外丙泊酚还能减少兴奋性氨基酸的产生，减少钙内流等。所以在正颌外科截骨降压时丙泊酚对神经细胞有保护作用。在今后正颌外科麻醉中控制性降压时可以大量使用，以发挥其脑保护的作用。

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[9]Chiara Adembri，Luna Venturi.Neuroprotective effects of propofol in acute cerebral injury[J].CNS Drug Reviews，2007，13（3）： 333-351.

[10]贾东林，褚晓玉，张利萍.丙泊酚对自由基引起的大鼠脑皮质线粒体损伤的保护作用[J].中国临床药理学与治疗学，2007，12（7）：763-765.

[11]Tsnjiguchi N，Yamakage M，Namiki A.Mechanisms of direct inhibitory action of propofol on uterine smooth muscle contraction inpregnant rats[J].Anesthesiology，2011，95（5）：1245-1255.

[收稿日期]2013-04-09 [修回日期]2013-05-03

编辑/张惠娟

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