草甘膦对蚯蚓体内抗氧化酶和AChE酶活性的影响

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摘  要  蚯蚓是土壤健康的关键指示生物，为了更好地评价草甘膦对土壤无脊椎动物的影响，本研究采用土壤法测定草甘膦对蚯蚓的急性毒性;用不同浓度的草甘膦分别测定不同暴露时间下对蚯蚓超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、谷胱甘肽S转移酶、乙酰胆碱酯酶活性的影响。结果显示，土壤法测定草甘膦对蚯蚓的LC₅₀>1000 mg/kg;在草甘膦的影响下，随着暴露时间的延长，蚯蚓SOD酶活力有着先增高后下降的趋势，CAT酶活力呈现着先下降后升高的趋势，随着时间和浓度的增长POD酶活力在草甘膦的影响下有逐渐下降的趋势;相对于空白对照，处理组AChE酶活力在草甘膦暴露14 d时显著降低。研究结果将为合理评价和监测草甘膦造成的土壤污染水平提供科学依据。

关键词  草甘膦;蚯蚓;急性毒性;酶活力中图分类号  X171.5      文献标识码  A

Effect of Glyphosate on the Activities of Antioxidase Enzymes and Acetylcholinesterases in Vivo Earthworm

WANG Bingjie^1，2， JIANG Lei^1，2*， PAN Bo^1，2， LIU Ying^1，2， LIN Yong^1，2*

1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Key Laboratory of Integrated Pest Management of Tropical Crops， Ministry of Agriculture & Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract  Earthworm （Eisenia fetida） is one of the key bio-indicators of soil health. To evaluate the effects of glyphosateon soil invertebrates， the acute toxicity of glyphosate to earthworms were determined by artificial soil test. Effects of different concentrations of glyphosate on the activities of superoxidedismutase （SOD）， catalase （CAT）， peroxidase （POD）， glutathions S-transferase （GST） and acetylcholinesterase （AChE） in earthworms were measured at different exposure durations. The results of artificial soil test showed that the LC₅₀ of glyphosate to earthworms was greater than 1000 mg/kg （7 d， 14 d）， indicating that the acute toxicity of glyphosate was low to earthworms. With the increase of glyphosate concentrations and exposure time， the activity of SOD in earthworms increased first and then decreased; the activity of CAT in earthworms decreased first and then increased; and the activity of POD in earthworms kept decreasing. Compared to the control， the activity of AChE in earthworms exposed to glyphosate reduced significantly after 14 days. The results would provide a scientific basis for rational evaluation and monitoring of soil pollution level caused by glyphosate.

Keywords  glyphosate; earthworm; acute toxicity; enzyme activity

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.019

草甘膦屬内吸传导广谱灭生性除草剂，对多年生深根性杂草地下组织有很强的破坏能力，能直接杀死杂草的根系，在抑制农地杂草、保护农作物生长方面发挥了巨大的作用，是目前世界上使用量最大的除草剂，广泛用于防除一年生和多年生杂草^[1-3]。伴随着草甘膦的大量使用，源源不断的草甘膦进入土壤;有研究表明，进入土壤中的农药一方面通过淋溶作用向下迁移进入地下水造成水污染，另一方面通过作物根部吸收进入农作物，对其生长发育造成胁迫，影响农作物产量和品质，甚至通过食物链进入人体，进而为害人类健康^[4-8]。

蚯蚓作为土壤环境中主要的动物类群，对维持土壤肥力起到重要作用，更是生态系统健康与否的重要指示生物。有大量文献表明研究农药对蚯蚓行为的影响对可持续农业的发展具有重要的意义^[9]。农药污染物对蚯蚓在个体、细胞和分子等不同生命层面都会产生毒理学作用。研究表明，草甘膦对蚯蚓的急性毒性较低，其LC₅₀值为6.3 mg/mL，属低毒级^[10]，并且有研究表明，草甘膦在土壤中浓度为996 µg/kg时，对蚯蚓没有影响^[11]。

除草剂可以诱导机体产生氧化应激反应^[12]，而蚯蚓体内有一系列的氧化防御机制，如抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽S转移酶（GST）^[13]，其中GST也可参与解毒代谢^[14];蚯蚓乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的变化是农药暴露研究的生物标志物之一^[15-16]。

本研究以蚯蚓为主要实验材料，通过土壤法研究除草剂草甘膦对蚯蚓的毒性和致死效应;并进一步研究蚯蚓超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽S转移酶（GST）和乙酰胆碱酯酶（AChE）活力在不同浓度草甘膦作用下的变化，研究结果将为科学地评价农药安全性提供基础数据支持。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试动物 赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）购自天津成功蚯蚓养殖场，购置的蚯蚓以发酵的牛粪经灭菌后作为饲料，于室温（20～25 ℃）下饲养。选用环带明显、体重为300～500 mg的成熟健康蚯蚓作为测试材料。实验前先把预培养的蚯蚓用蒸馏水洗干净，放在有湿润滤纸的培养皿中，使蚯蚓清肠、吐泥24 h^[17]。

1.1.2  供试土壤  实验土壤采用人工土壤：68%的石英砂、20%的高岭土、10%的泥炭藓、2%碳酸钙，调节pH为6.0±0.5，各组分总质量为500 g。

1.1.3  供试药品和试剂  草甘膦原药（95%），麦克林公司;酶活性检测试剂盒，南京建成生物工程研究所;其他试剂均购于西陇化工有限公司。

1.2  方法

1.2.1  人工土壤法毒性实验  急性毒性实验中，根据预实验结果设置草甘膦染毒土壤浓度为0、200、400、600、800、1000 mg/kg。染毒方法按照化学品对蚯蚓毒性试验国家标准（GB/T 21809-2008）进行，将500 g人工土壤放入1 L的烧杯中加入175 mL用去离子水溶解的草甘膦，充分混匀使其达到所设定的浓度，同时设水为空白对照，每个处理3个重复。然后将10条清肠24 h的健康蚯蚓放入染毒土壤的烧杯中，用纱布封口，防止蚯蚓逃逸。将蚯蚓放入人工气候箱内[温度（20±1）℃，湿度80%±2%，光照强度为800 lx，光暗比14 h∶10 h]培养，分别在第7天和第14天观察记录蚯蚓的死亡数。

1.2.2  草甘膦对蚯蚓体内酶活性的影响  为了进一步了解除草剂草甘膦对赤子爱胜蚓的毒性效应，采用人工土壤法研究了草甘膦胁迫对赤子爱胜蚓氧化防御系统酶SOD、CAT、POD 活性及谷胱甘肽-S转移酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响。根据草甘膦田间使用量和急性毒性的实验结果设置6个浓度，分别为0、2、10、50、150、450 mg/kg，实验条件和方法同1.2.1节，每个浓度设置3 个重复。分别在培养第3、7、14、21 天随机从每份土壤中取出2条蚯蚓用于酶活性测定，在整个实验周期内未见蚯蚓死亡。

粗酶液的提取和蛋白含量的测定：将清肠24 h的蚯蚓用去离子水洗净，吸干水分，称重，放入预冷的25 mL玻璃匀浆器中，然后加入9倍体积预冷的生理盐水，冰浴研磨成10%的组织匀浆，在-80 ℃的超低温冰箱中保存，以备SOD、POD、CAT、GST和AChE活性测定。蛋白含量采用Bradford^[18]的方法测定，以牛血清蛋白（BSA）作为标准蛋白，在595 nm下测定样品的吸光度。SOD、CAT、POD、GST和AChE活性的测定均按照南京建成试剂盒说明书进行。

1.3  数据处理

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，所有实验结果表示为平均数±标准偏差（Mean±SD），利用单因素方差分析法（one-way ANOVA）中post hoc-LSD法进行对照组和浓度组之间的差异显著性分析，并用GraphPad Prism 7软件绘图。

2  结果与分析

2.1  草甘膦对蚯蚓急性毒性

在实验的第7、14天检查死亡率，发现对照和处理组均没有出现蚯蚓死亡现象，即研究结果显示LC₅₀>1000 mg/kg。

2.2  草甘膦对蚯蚓体内抗氧化酶活性的影响

2.2.1  对蚯蚓体内SOD活性影响  草甘膦对赤子爱胜蚓SOD活性影响如图1所示，在暴露第3天和第7天时各浓度草甘膦处理组SOD酶活性均显著高于空白对照组，暴露第3天时浓度为50 mg/kg草甘膦处理的酶活力最高，较对照提高了25.48%。暴露第7天时，与对照相比，浓度为10、150、450 mg/kg处理时蚯蚓体内SOD活性显著提高（P<0.01），分别提高了40.18%、38.76%和40.03%。在10、50、150和450 mg/kg浓度下暴露第14天时，蚯蚓体内SOD酶活性显著下降，分别较对照下降了41.12%、34.47%、39.48%和43.62%。在暴露第21天時各浓度草甘膦处理组与空白对照组均无显著差异。

2.2.2  对蚯蚓体内CAT活性影响  草甘膦对赤子爱胜蚓CAT活性影响如图2 所示，在暴露第3天时只有浓度为2 mg/kg草甘膦处理的CAT活性显著高于空白对照组。暴露第7天时，各浓度草甘膦处理组CAT活性均显著高于空白对照组，分别提高了33.64%，73.89%、36.61%、45.16%和60.77%，其中浓度为10 mg/kg草甘膦处理组的CAT酶活力最高。暴露第14天时，只有浓度为10 mg/kg时CAT活性显著增高，提高了76.21%。在暴露第21天时各浓度草甘膦处理组与空白对照组均无显著差异。

2.2.3  对蚯蚓体内POD活性影响  草甘膦对赤子爱胜蚓POD活性影响如图3所示，在暴露第3天和第7天时各浓度草甘膦处理组与空白对照组均无显著差异。暴露第14天时草甘膦浓度为50和450 mg/kg的处理组POD酶活力降低，分别较对照下降了16.83%和35.76%。暴露第21天时，浓度为150和450 mg/kg草甘膦处理组酶活力降低，分别较对照下降了22.69%和21.60%。

2.2.4  對蚯蚓体内GST活性影响  草甘膦对赤子爱胜蚓GST活性影响如图4所示，在暴露第3天时，草甘膦浓度为2、50、150和450 mg/kg的处理组CAT酶活力显著低于空白对照组，分别降低了29.64%、14.87%、29.07%和36.29%，浓度为450 mg/kg草甘膦处理组GST酶活力最低。暴露第7天时，浓度为50和450 mg/kg草甘膦处理组GST酶活性显著低于空白对照组，分别下降了36.52%和44.10%。暴露第14天时，各浓度草甘膦处理组GST酶活性均显著低于空白对照组，分别下降了35.75%、47.95%、68.76%、57.93%和64.13%。暴露第21天时，浓度为50、150和450 mg/kg的草甘膦处理组GST酶活性均显著低于空白对照组，分别下降了46.58%、70.35%和73.63%。

2.2.5  对蚯蚓体内AChE活性影响  草甘膦对赤子爱胜蚓AChE活性影响如图4所示，在暴露第3天和第7天时，只有在草甘膦浓度为150 mg/kg的处理组AChE酶活性显著低于空白对照组，分别降低了48.31%和29.46%。暴露第14天时，各浓度草甘膦处理组AChE酶活性均显著低于空白对照组，分别下降了16.89%、34.43%、43.33%、35.63%和49.64%。在暴露第21天时各浓度草甘膦处理组AChE活性与空白对照组均无显著差异。

3  讨论

蚯蚓急性毒性研究在蚯蚓生态毒理学研究中具有重要的意义，通过急性毒性实验可以得出化学品对蚯蚓直接致死率与剂量之间的关系，明确化学品对蚯蚓的毒性等级^[19]。人工土壤法测定蚯蚓毒性实验，模拟了蚯蚓的生活环境，可为化学品对蚯蚓的毒性评价提供较为准确的结果^[20]。根据国家蚯蚓急性毒性实验标准，本研究采用人工土壤法测定了草甘膦对赤子爱胜蚓的急性毒性。研究结果显示草甘膦原药在第7天和第14天时对蚯蚓的LC₅₀大于1000 mg/kg，属于低毒级，该研究结果与Wang等^[21]的报道相一致。

本研究中，在暴露第3天和第7天时各浓度草甘膦处理组SOD酶活性均显著高于空白对照组。第3天，50 mg/kg草甘膦浓度时SOD酶活性为最高，而后活性降低，说明暴露第3天时，蚯蚓产生了明显的应激反应。而暴露14 d时，在10、50、150和450 mg/kg浓度下，蚯蚓体内SOD酶活性显著下降。随着时间的延长和浓度的增大，SOD酶活性均呈现先增高再降低的趋势。前期SOD活性增强的原因可能是为了维持机体自身的氧化平衡，蚯蚓体内抗氧化防御系统被激活，刺激SOD的合成来清除过多的氧自由基，而后出现下降的原因可能是蚯蚓机体内环境稳态遭到破坏，机体受损程度增强，体内的自稳机制被打乱，而导致SOD酶活力下降^[22-23]。该结果与已有研究中草甘膦对蚯蚓体内SOD酶活性的影响随浓度和时间递增整体呈现先升高后下降的趋势相符^[24-25]。然而也有研究表明水生生物凯氏小球藻（Chlorella kessleri）暴露于40～70 mg/L草甘膦时SOD活性显著提高，未发现SOD活性显著下降现象^[26]。

CAT和POD可以有效地协同将SOD歧化自由基产生的过氧化氢分解，从而消除其对生物体的氧化毒害^[27]。在本研究中，暴露第3天和第7天时，草甘膦胁迫下蚯蚓体内CAT活性显著高于空白对照，而之后与对照无显著差异（图2）。而草甘膦胁迫下的POD活性在暴露前期与对照无显著，随着暴露时间的延长，在第14天和第21天，高浓度胁迫下POD活性显著低于空白对照（图3）。这可能是由于随着暴露时间的延长，因草甘膦降解而生物有效性降低，对蚯蚓的氧化胁迫逐渐减少，CAT活性逐渐恢复至对照水平，POD则继续承担清除高浓度草甘膦胁迫下蚯蚓体内H₂O₂的任务，大量POD被消耗从而表现出酶活性持续低于对照水平的现象。然而也有研究发现，蚯蚓在被草甘膦污染的土壤中暴露7 d后，对过氧化氢酶（CAT）活性无显著影响^[25]，但与本研究结果一致的是在暴露第14天和第21天CAT活性逐渐恢复至对照水平;而在21 d时，空白对照组SOD明显降低，POD活性明显提高，是由于人工土壤中未添加其他食物，导致蚯蚓生命活力降低，产生更多的氧自由基，SOD消耗歧化自由基产生过氧化氢，为维持机体平衡，POD酶活力增高来清除蚯蚓体内的H₂O₂。

本研究发现，草甘膦处理后显著降低了GST酶活力（图4）。有研究显示，草甘膦处理28 d后，Octolasion cyaneum GST活性被抑制^[28]，然而在草甘膦暴露24 h和98 d后，条纹鲮脂鲤（Prochilodus lineatus）GST活性升高^[29]。然而空白對照组蚯蚓GST酶活力也会随着时间的延长而降低，蚯蚓生命活力降低，为保护蚯蚓免受氧化损伤，消耗GST酶来清除体内的脂类过氧化物^[30]。本研究发现草甘膦对蚯蚓AChE酶活力有抑制作用，这可能归因于草甘膦属于有机磷类除草剂，其作用机理是抑制胆碱酯酶活性，胆碱酯酶失去分解乙酰胆碱的能力，导致乙酰胆碱在体内积蓄过多而中毒^[31];而乙酰胆碱酯酶活性的变化与氧化应激和细胞内离子稳态的变化有关^[32-33]，研究结果与宋欣媛等^[24]和Hac kenberger等^[25]报道一致。

本研究结果表明草甘膦对赤子爱胜蚓低毒。在受试浓度范围草甘膦对蚯蚓体内SOD、CAT、POD、GST和AChE活性均有不同程度影响，但随着暴露时间的延长，14 d后草甘膦对蚯蚓的氧化胁迫基本消失，说明供试浓度内草甘膦不会对蚯蚓造成明显的氧化损伤。本研究仅确定了草甘膦原药对蚯蚓的急性毒性和短期内氧化胁迫的影响，但草甘膦农药制剂复杂，商品农药中的助剂或其他成分也可能比草甘膦活性成分对蚯蚓有更大的毒性作用^[34-35]，并且有研究表明，长期使用草甘膦除草剂的土壤中发现蚯蚓种类、密度和生物量均减少^[36]。所以进一步研究草甘膦慢性毒性对蚯蚓本地物种的生长发育和繁殖的影响，可以更好地了解其对生态系统的影响。

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