羊膜自噬的形态及其相关基因表达

[摘要] 目的：阐明羊膜上皮细胞自噬过程的形态及其相关基因表达。方法：20片足月羊膜用透射电镜检查，用单丹磺酰戊二胺（MDC）标记自噬泡和溶酶示棕红（LTR）检查溶酶体；用RT-PCR检测beclin-1，apg-5和DAPK基因的转录。结果：在羊膜上皮可见多数双层膜包被的自噬泡，它可分为两种：一种是自噬体，其中包含细胞浆成份；另一种是自噬溶酶体，系自噬体和溶酶体融合，细胞浆成份降解。MDC和LTR染色阳性。beclin-1，apg-5和DAPK基因在多数羊膜上皮有表达。结论：在正常羊膜上皮出现自噬并有相关基因表达，羊膜上皮为适应其营养限制可诱导自噬以促进自我营养。

[关键词] 羊膜；自噬；自噬体；自噬溶酶体

[中图分类号] R714.56[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）08（a）-011-03

Morphology of autophagy and expression of some relative genes in amnion

LU Shan-qun1, SHEN Zhong-ying2

（1.Department of Obstetrics, Central Hospital of Shantou, Shantou 515011，China; 2.Department of Pathology, Medical College of Shantou University, Shantou 515011, China）

[Abstract] Objective: To expose the morphology of autophagy and expression of some associated genes in the amnion. Methods: Twenty pieces of amnions in term gestation were examined by transmitted electron microscopy and by mono-dansylcadaverin (MDC) and LysoTracker Red (LTR) staining, markers for autophagic vacuole and lysosome. Autophagy-associated genes, beclin-1, apg-5 and DAPK were assayed by RT-PCR. Results:Most autophagic vacuoles enclosed with double membranes were found in the amniotic epithelial cells. They were divided two kinds: autophagosomes, in which contained some cytoplasmic compartments, and autolysosomes, in which autophagosome fused with lysosomes and contained degraded cytoplasmic compartments. MDC and LTR staining was positive in the cytoplasm. beclin-1, apg-5 and DAPK genes were expressed in great proportion of amniotic epithelium. Conclusion:These results display that the phenotype of autophagy are induced in normal amniotic epithelium with some autophagy-associated genes expression, and suggest that amniotic epithelia adapt to the nutrient limitation by inducing autophagy to promote self-nourishment.

[Key words] Amnion; Autophagy; Autophagosome; Antolysosome

羊膜是子宫内包被胎儿的一层薄膜，对胎儿有保护作用。羊膜是一种生物膜，它结构简单，仅有一层上皮细胞位于基膜上及其下的一薄层结缔组织，由于羊膜无血管供应，细胞通过羊水营养物质维生，故其有耐“饥饿”的特点。由此羊膜可用于临床多种用途：如覆盖创面，用在烧伤和眼表面损伤[1]；器官移植和再造[2]；近期羊膜上皮细胞用于治疗Parkinson综合症[3]。建立和利用羊膜库[4]是一种有益的开辟性的工作。

在寻找细胞程序性死亡模型的研究中，发现足月羊膜上皮凋亡（apoptosis，type Ⅰ）现象非常明显[5]，其间羊膜上皮也伴有明显自噬（autophagy）现象。自噬也称为Ⅱ型凋亡（apoptosis，type Ⅱ）是一种普遍存在于有核细胞的生物现象，有重要的生理和病理意义。国外继凋亡之后研究自噬现象又掀起高潮，Science杂志称自噬是2005科技领域六个研究热点之一。有人认为羊膜早破与羊膜上皮程序性死亡机制有关，但对羊膜自噬现象的研究至今尚未涉及。要充分利用羊膜就要对其生物学特性充分了解，为此利用正常分娩的羊膜，用透射电镜观察羊膜上皮自噬的形态衍变过程和生物化学标志，并用RT-PCR检测某些相关基因的表达。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂0.05 mmol/L MDC（Sigma）、5 μmol/L LTR（Molecular Probes, Eugenes, OR）、荧光显微镜检查（Nikon Fluophot）、TRIzol试剂（Invitrogen，USA）

1.1.2主要仪器细胞离心机（Cytospin 3，Shandon Inc.）、透射电镜（Hitachi H-300）、ABI-2400 PCR仪（Thermal cycler，Applied Biosystems）。

1.2方法

1.2.1羊膜和羊膜上皮细胞分离20片足月胎盘羊膜非胎盘反折部份，用生理盐水洗5次，剪碎部份组织作电镜检查；部分用0.25%胰酶消化，收集游离的羊膜上皮细胞，用细胞离心机（Cytospin 3，Shandon Inc.）将细胞离心在玻片上，或离心成团提取RNA。

1.2.2透射电镜检查小块羊膜（1 mm3），用2.5%戊二醛固定，后固定用2%锇酸（osmuim tetraxide），脱水、包埋、超薄切片，用醋酸铀和枸橡酸铅染色，用透射电镜（Hitachi H-300）检查。

1.2.3单丹磺酰戊二胺（mono-dansylcadaverin，MDC）自噬泡标记根据Biederbick方法[6]，玻片上羊膜细胞用0.05 mmol/L MDC（Sigma）孵育60 min，37℃。PBS洗后荧光显微镜观察。

1.2.4溶酶示踪红（LysoTracker Red，LTR）溶酶体标记羊膜上皮细胞离心在玻片上，用5 μmol/L LTR（Molecular Probes, Eugenes, OR）染色30 min，37℃。PBS洗，荧光显微镜检查（Nikon Fluophot）。

1.2.5RT-PCR检查beclin-1，apg-5和DAPK基因羊膜组织PBS洗后，消化脱落的上皮细胞用匀浆磨碎，用TRIzol试剂（Invitrogen，USA）提取总RNA，方法如说明书。取1 μg总RNA应用Promega公司反转录系统进行反转录，总量为20 μl。所有标本2.0 μl cDNA分别加上10 pmol beclin-1，apg-5和DAPK引物，PCR反应用ABI-2400 PCR仪（Thermal cycler，Applied Biosystems）完成，用GAPDH基因作内对照。

1.2.6引物设计根据GenBank，beclin-1，apg-5和DAPK序列设计3对引物，beclin-1引物：5’ TGGATCACCCACTCTGTGAG 3’，5’ TTATTGGCCAGAGCATGGAG 3’(GenBank Accession #AF139131），产物565 bp；apg-5引物：5’TTTGGCTTTGGTTGAAATAAG 3’，5’ TGTCATTTTGCAATCCCATC 3’（GenBank Accession #BC002699），产物539 bp；DAPK引物：5’ ACCTGCACTCCCTTCAAATC 3’，5’ CAGAGTATCATCGCTTCTGGC 3’（GenBank Accession #X76104），产物626 bp；GAPDH引物：5’ CCCCTACTGCCTATATCGAC 3’，5’ AATGATACGGGTGCTCTGAG 3’。

2结果

2.1羊膜透射电镜检查

羊膜结构简单，在基底膜停留单层羊膜上皮细胞，其下为疏松和致密的结缔组织，羊膜上皮细胞内有多种膜被小泡，有一种两层膜包的自噬泡（autophagic vacuole）两层膜内含有各种细胞成份，称为自噬体（autophagosome），另有一种双层膜或单层膜包被自噬泡，除了被吞噬的细胞成分外尚有溶酶体参与其间，称为自噬溶酶体（autolysosome）（图1）。

自噬泡形成过程分为四步聚：①分隔膜（isolation membrne）形成（图2A）一段杯状内质网（ER）两层膜包被受损的细胞器。②包被的两层膜互连接包绕细胞器形成自噬体（图2B）。③溶酶体和自噬体相结合，形成自噬溶酶体（autolysosome）。④自噬溶酶体内消化各种细胞成分或残留一些残体（residual bodies）。

图2 自噬泡发展的超微结构

（TEM ×20 000）

（A：部份双层膜包被退化的线粒体，B：自噬体形成双层膜内包涵退化线粒体，n：细胞核，箭头：双层膜。）

2.2生物化学标记

2.2.1MDC标记自噬体羊膜上皮经MDC孵育后，在荧光显微镜下可见胞浆有点状阳性标记物（图3）证明有自噬泡形成。

图3羊膜上皮细胞自噬泡MDC染色

（MDC×400）

（胞浆出现MDC阳性点状物）

2.2.2LTR标记溶酶体羊膜上皮细胞胞浆有散在或排列在核周成圈的红色亮点标记，是溶酶体的酸性成份（图4）。

图4溶酶体LTR荧光标记

（LTR×400）

（羊膜上皮细胞荧光亮点标记溶酶体和自噬溶酶体。）

3.3自噬相关基因表达

羊膜上皮细胞beclin-1，apg-5和DAPK基因表达（图5）：20份羊膜，RT-PCR检测，beclin-1，17例阳性；apg-5，18例阳性；DAPK，15例阳性。说明这些基因和自噬有关。

图5RT-PCR检测自噬相关基因

（A：beclin-1；B：apg-5和C：DAPK gene有条带，D：GAPDH。

Am：羊膜标本；M：marker。）

3讨论

细胞自噬现象是从酵母直至哺乳类细胞皆出现的生物现象，不同类别生物其自噬相关基因相似性说明自噬在生物进化过程很保守，同时说明它对各种细胞有重要作用。正常情况下，多数细胞自噬现象处于不活跃状态，只有在特定条件及刺激下，细胞自噬可被激活。在检查胎盘羊膜时，发现羊膜上皮有自噬现象，相关自噬基因也有高转录，说明羊膜上皮是一种自噬良好模型，可以用于自噬的基础理论和自噬调控的研究。

细胞自噬现象的诊断，自从Ashford和Porten发现自噬现象起，对自噬的诊断皆用透射电镜下的超微结果为凭证，因此电镜诊断是唯一方法[7]，并被认为是金标准。自噬现象主要在细胞内出现自噬体，它是一双层膜囊胞，内含自食小泡或胞浆成份。自噬体和溶酶体结合，形成自噬溶酶体，消化自噬内容。自噬体或自噬溶酶体为其诊断标志物。其他各种生物化学方法和荧光标记方法，如GFP-LC3，MDC，吖叮橙和LTR等仅标记自噬泡某一成分，作为辅助诊断。

羊膜上皮细胞有较高自噬表型。这是由于羊膜是由单层上皮细胞附着于基底膜上及其下结缔组织构成，无血管供应。羊膜上皮细胞营养物主要来源于羊水，通过羊膜上皮表面微绒毛的内吞（Endocytosis）和吞噬（phagocytosis）将羊水成份摄入细胞内，由于羊水内营养物质有限，因此羊膜上皮处于“饥饿”状态，营养缺乏可诱导自噬启动[8]。如将羊膜培养在完全培养基，自噬现象消减证明营养缺乏是启动自噬重要因素。

自噬对羊膜有何意义？自噬可以使一些细胞器，特别是衰老的或受损的细胞器，通过自噬体被溶酶体消化。这些降解的蛋白质重新进入再循环，再利用。因此，自噬对细胞器有更新作用，对细胞内蛋白的新陈代谢过程有重要调节作用。自噬可以清除细胞内的废物而起保护细胞作用，对延长细胞寿命和延缓老化也有重要作用。通过其吞噬和消化途径对内侵的细菌，病毒也有防御作用。有报道认为自噬可以保护细胞免于凋亡和坏死[9]，由于自噬可以清除受损的线粒体，避免线粒体释放凋亡因子（如细胞色素C），未形成caspases级联活化，防止凋亡的产生。但有报道认为自噬和凋亡同时存在或形成自噬性凋亡（autophagic apoptosis）[10]。我们在羊膜上皮也观察到既有自噬泡形成，又有凋亡的典型改变（另文）。

总之，羊膜上皮在生理条件下出现较丰富的自噬现象，并有自噬相关基因表达。这将做为开展自噬研究的良好模型。我们认为，羊膜上皮细胞产生大量的自噬泡可能是由于羊膜上皮处于营养缺乏所致，为了适应这种营养缺乏，细胞产生自噬以促进自我营养。

[参考文献]

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[5]沈忠英, 陈铭华, 沈健, 等. 羊膜上皮程序性细胞死亡的超微结构研究[J].电子显微学报, 2000, 19(3): 259-260.

[6]Biederbick A, Kern HF, Elsasser HP. Monodansylcadaverine (MDC) is a specific in vivo marker for autophagic vacuoles[J]. Eur J Cell Biol, 1995, 66(1): 3-14.

[7]Mizushima N. Methods for monitoring autophagy[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(12): 2491-2502.

[8]Onodera J, Ohsumi Y. Autophagy is required for maintenance of amnio acids levels and protein synthesis under nitrogen starvation[J]. J Biol Chem, 2005, 280(36): 15.

[9]林芳, 顾振纶, 秦正红. 自噬及其在细胞代谢和疾病中的作用[J]. 生物化学与生物物理进展, 2005, 32(4): 298-303.

[10]朴英杰, 黄行许, 霍霞, 等. 淋巴细胞自噬性凋亡的超微结构细胞化学研究[J]. 第一军医大学学报, 1996, 16(3): 165-171.

（收稿日期： 2008-07-01）

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