甜瓜自毒作用相关MYB转录因子的克隆和表达分析

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 甜瓜品种：“新银辉”，购于福建省农嘉种业股份有限公司。

1.1.2 菌株和试剂 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自Fermentas公司；SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Clontech公司；pMD-18T Vector、PrimeScript RT Reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒、SYBRR Premix Ex Taq TM （Tli R NaseH Plus）均购自大连宝生物公司；大肠杆菌DH5ɑ为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 植株浸提液的获取 选取新鲜健康甜瓜植株，用蒸馏水冲洗干净，100 ℃杀青25 min，然后60 ℃烘干至恒重，研磨成粉，混合均匀后称取15 g，加500 mL无菌ddH2O，密封震荡（90 r/min）室温下浸提2 d，依次用纱布、滤纸和0.2 μm孔径47 mm直径的微孔滤膜过滤，无菌dd H2O定容，即得浓度为0.03 g/mL的浸提液。前期研究显示此浓度处理对甜瓜植株有明显的自毒效应，且不足以致死。

1.2.2 植物材料的处理 甜瓜健康植株长到三叶一心时进行处理，在无土栽培基质（珍珠岩、蛭石、泥炭体积比为3 ∶ 1 ∶ 1）中添加10 mL浓度为0.03 g/mL植株浸提液进行胁迫处理，以无菌蒸馏水为对照。分别于处理1、2、3、4 d后采集甜瓜的根、茎和第3～4叶位的叶片，放入液氮速冻后置于-80 ℃冰箱中保存，用于提取RNA。

1.2.3 总RNA提取和cDNA合成 利用植物多糖多酚提取试剂盒（百泰克）分别提取甜瓜叶片、茎和根的总RNA，并检测其纯度和完整性，参照试剂盒说明书（Fermentas），取1 μg RNA反转录cDNA。

1.2.4 MYB转录因子的克隆和分析 根据前期研究获得的MYB核心区序列[1]，设计3′和5′引物（表1）。PCR反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，49～54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。3′ RACE和 5′ RACE分别使用2轮巢式引物进行扩增，第1轮产物稀释10倍作为第2轮模板，第2轮PCR产物经电泳检测后回收目的片段。回收产物纯化后连入载体pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α，对获得的阳性克隆进行测序，利用DNAMAN拼接MYB cDNA全长，据此设计ORF引物，PCR扩增获得全长。利用ProtParam程序预测该序列编码产物的分子量、理论等电点以及蛋白质疏水性等信息；通过 TMpred Server软件进行氨基酸序列跨膜分析；通过NCBI在线软件搜索同源序列，利用DNAMAN软件进行相关氨基酸序列的同源性分析；用MEGA5.2构建系统进化树，并与其他植物的MYB转录因子进行比对分析。

1.2.5 MYB转录因子的实时荧光定量PCR分析

分别以0、1、2、3、4 d胁迫处理的甜瓜叶片总RNA为模板，采用PrimeScript RT Reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒合成cDNA第一链。根据SYBRR Premix Ex Taq TM（Tli R NaseH Plus）使用说明书，用罗氏 LightCycler 480荧光定量PCR仪对MYB转录因子在处理的不同阶段表达量进行分析。反应程序：94 ℃ 10 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，40个循环。实验设3次重复。以甜瓜Actin作为内参基因校正和标准化目的基因。

2 结果与分析

2.1 甜瓜MYB转录因子的克隆和生物信息学分析

PCR扩增获得长1 164 bp的cDNA 序列（图1），包含一个885 bp的完整阅读框，编码294个氨基酸，包括174 bp的5′非翻译区，105 bp的3′非翻译区（图2）。预测蛋白质分子量为32.2 ku，理论等电点为9.42。该基因编码较多的氨基酸为丝氨酸、脯氨酸、甘氨酸、亮氨酸等。带负电的氨基酸（Asp+Glu）29个，带正电的氨基酸（Arg+Lys）35个，脂肪系数64.69，总平均疏水性（GRAVY）值为-0.713。Blast结果显示实验中获得的甜瓜MYB转录因子属于R2R3-MYB 类型。

通过NCBI在线软件找到8条同源性较高的R2R3-MYB类转录因子序列，对这些转录因子和甜瓜R2R3-MYB类转录因子编码的氨基酸序列进行同源性分析，结果如图3所示。该基因与不同植物（甜橙、梅花、麻疯树、蓖麻、黄瓜、淫羊藿、花生和苜蓿）R2R3-MYB类转录因子编码的氨基酸序列同源性为48%～98%，表明R2R3-MYB类转录因子类型的多样性，但不同植物间R2R3-MYB类转录因子结构域高度保守。其中与黄瓜（XP_004142878.1）的同源性达97.28%。

甜瓜R2R3-MYB类转录因子与部分已知植物R2R3-MYB 类转录因子编码的氨基酸序列构建的系统发育树如图4。甜瓜R2R3-MYB类转录因子同黄瓜MYB44-like 转录因子（XP_004142878.1）基因聚类关系最近；麻疯树（AFV73403.1）与蓖麻（XP_002510155.1）同为大戟科，聚为一类；花生（AHB59592.1）与苜蓿（XP_003611666.1）同属芸香科，聚为一类；甜橙（NP_001275798.1）与梅花（XP_008220277.1）为不同科，但聚为一类；小檗科的淫羊藿单独成类。

2.2 甜瓜MYB转录因子在不同处理时期表达量的分析

在植株浸提液介导的自毒作用过程中，甜瓜叶片、茎和根中该MYB转录因子表达量变化的荧光定量PCR检测结果如图5。植株浸提液处理2 d时，根和叶部位R2R3-MYB转录因子的表达量变化最明显，分别是对照的35.37倍和13.41倍，随后逐渐降低；而在茎部其相对表达量变化不明显。说明R2R3-MYB转录因子在自毒诱导初期表达量迅速增加，此后逐步降低，该转录因子可能参与了甜瓜自毒相关基因初期的诱导表达，进而使植株对自毒胁迫做出主动的系统性应答反应。

3 讨论与结论

本研究获得的甜瓜自毒作用相关MYB转录因子为R2R3-MYB类，此类是目前植物中研究数目最多的一类MYB[17]，如在拟南芥中已经发现126个R2R3-MYB成员[18]，该家族基因特点是在N-端含有由2个MYB结构域构成的DNA结合功能域，而在C-端绝大多数都具有转录激活功能域。Kranz等[19]根据植物R2R3-MYB的C-端氨基酸序列将其进一步细分为22个亚组，在植物次生代谢、细胞形态发生、激素刺激和环境胁迫应答、分生组织形成及细胞周期控制等多个环节中均起关键性作用[20-25]。

转录水平上调控相应基因的表达是植物对逆境胁迫最初的反应，此类调控往往是由启动子和对应转录因子共同完成的。 研究结果证明，紫外辐射、高盐、干旱等逆境胁迫可提高大豆GmMYBJ6在自身体内的表达水平[24]；干旱诱导胁迫处理下，拟南芥Atmyb2可使耐盐基因rd22 表达上调[26]。本实验结果表明在自毒胁迫初期（2 d）时，甜瓜R2R3-MYB转录因子的表达量最高，此后逐渐降低，该转录因子可能参与和调控了相关基因的诱导表达，最终形成植株在生理、生化和形态等水平上应激反应，降低或消除胁迫伤害。了解MYB转录因子的作用机理对于揭示甜瓜自毒胁迫应答基因的表达调控有重要意义。

研究表明大豆中GmMYBJ6基因可提高类黄酮代谢途径中的苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）、查尔酮合成酶（CHS）、黄酮醇合成酶（FLS）等关键酶的表达[24]；金鱼草中AmMYB305与AmMYB340共同调控苯丙烷代谢途径第一个酶PAL的合成[27]，而苯丙烷代谢途径中的多个中间产物和瓜类化感作用密切相关。本实验室前期研究表明此代谢过程中间产物肉桂酸、香豆酸、查尔酮和柚皮苷等物质均为甜瓜重要的化感自毒物质[15]，这从一个侧面证实了本实验获得的MYB转录因子和甜瓜化感自毒作用密切相关。甜瓜MYB转录因子可能通过影响苯丙烷代谢途径中多个相关酶的合成，进而对化感自毒物质的产生和累积起到一定的调控作用。

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