牛双芽巴贝斯虫rap-1基因的克隆与序列分析

摘要：对牛双芽巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ）潜在药物靶标Rａｐ－１的基因进行克隆与序列分析。以兰州株牛双芽巴贝斯虫基因组为模板，经ＰＣＲ扩增获得了ｒａｐ－１基因，将该基因克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ上，对重组质粒进行ＰＣＲ扩增，对目的基因进行酶切鉴定及序列测定分析。结果表明，ｒａｐ－１基因长度为８４６ ｂｐ，同源性分析结果显示，克隆序列与ＧｅｎＢａｎｋ收录的巴西株牛双芽巴贝斯虫的核苷酸序列同源性为９９．７４％，说明兰州株牛双芽巴贝斯虫的ｒａｐ－１与ＧｅｎＢａｎｋ公布的参考基因具有高度同源性，ｒａｐ－１基因具有很高的保守性。

关键词：牛双芽巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ）；ｒａｐ－１基因；克隆；序列分析

中图分类号：Ｓ８５２．７；Ｑ７８９ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）06－1251-03

Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｐ－１ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ

ＨＡＮ Ｌｉｎ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｊｉ－ｙｕ２，ＹＵＡＮ Ｌｉ－ｇａｎｇ１，ＬＩ Ｂｉｎｇ２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｌａｎｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ａｎｉｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００５０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｒａｐ－１ ｇｅｎｅ， ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｌａｎｚｈｏｕ ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ， ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＰＣＲ， ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ Ｂ. ｂｉｇｅｍｉｎａ ｒａｐ－１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ８４６ ｂｐ． Ｔｈｅ ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｌｏｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｗａｓ ａｓ ｈｉｇｈ ａｓ ９９．７４％， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｒａｐ－１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ； ｒａｐ－１； ｃｌｏｎｅ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙsis

牛双芽巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ）在分类学上属梨形虫目巴贝斯虫科巴贝斯虫属，该类寄生虫寄生于牛的红细胞，引起牛的血液原虫病——牛双芽巴贝斯虫病［１］。牛双芽巴贝斯虫病又称红尿热，一年内可暴发数次，临床主要表现为红细胞数量明显减少、贫血、黄疸、可视黏膜出血和血红蛋白尿等，可引起宿主死亡［２］，该病是世界公认的危害养牛业的主要寄生虫病之一。牛双芽巴贝斯虫入侵红细胞的过程是感染发病的重要环节，对红细胞的入侵是由位于牛双芽巴贝斯虫细胞膜表面的顶体复合器以及棒状体上的相关蛋白质介导的［３］，位于棒状体的蛋白质家族被称为Rａｐ－１（Ｒｈｏｐｔｒｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）［４－６］，研究该类蛋白质的生物学特性及其功能对以Rａｐ－１为靶标的药物筛选和牛双芽巴贝斯虫病的防治具有重要意义。目前国内基本没有针对Rａｐ－１的相关研究和报道。

试验对兰州株牛双芽巴贝斯虫株的ｒａｐ－１基因进行ＰＣＲ扩增与序列测定，旨在分析比较该基因在不同虫株中的差异，为该基因的表达和生物学功能的进一步研究奠定基础。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 质粒与菌株 质粒ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ和大肠杆菌感受态细胞ＪＭ１０９均购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。

１．１．２ 主要试剂 血液ＤＮＡ提取试剂盒、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒、ＥｃｏＲ Ｉ限制性内切酶、ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ、ＤＬ５０００ Ｍａｒｋｅｒ、ＩＰＴＧ等均为ＴａＫａＲａ公司产品；Ｘ－ｇａｌ购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；质粒提取试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公司；Ｇｏｌｄｅｎ Ｅａｓｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ购自ＴＩＡＮＧＥＮ公司。

１．２ 方法

１．２．１ ＰＣＲ模板的制备 采集兰州地区经镜检和ＰＣＲ法确诊为被牛双芽巴贝斯虫感染的阳性的血液，加入柠檬酸钠抗凝剂。用血液ＤＮＡ提取试剂盒提取兰州株牛双芽巴贝斯虫全基因组，操作方法参考试剂盒说明书。

１．２．２ 引物设计与合成 根据ＧｅｎＢａｎｋ中巴西株牛双芽巴贝斯虫基因ｒａｐ－１序列（登录号：Ｎｏ．ＡＦ０１４４８６．１）设计引物，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。上游引物：５′－ＴＡＣＧＣＡＴＡＧＣＡＧＴＡＣＣＴ

ＣＴＡＧＡ－３′；下游引物：５′－ＴＴＧＧＴＣＧＴＣＧＴＴＴＡＴＴＴＣ

ＧＡＡＣ－３′。

１．２．３ 目的基因的ＰＣＲ扩增及电泳鉴定 ＰＣＲ反应体系：ＤＮＡ模板４ μＬ，上、下游引物各１．０ μＬ，Ｇｏｌｄｅｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．１６ μＬ，２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １２．５ μＬ，用灭菌水补充至２５ μＬ。ＰＣＲ反应条件：９５ ℃预变性４ｍｉｎ；９４ ℃变性４５ ｓ，５５ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。用１％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物。

１．２．４ ＰＣＲ产物回收与纯化 ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳后，将目的条带切下，参照ＰＣＲ产物纯化回收试剂盒说明回收目的ＤＮＡ，于－２０ ℃保存。

１．２．５ ｒａｐ－１基因的克隆 连接体系：ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ １μＬ，ｒａｐ－１ ＰＣＲ纯化回收产物３ μＬ，２×Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １ μＬ，共计１０ μＬ。在１６ ℃条件下连接过夜，连接产物命名为ｐＧＥＭ－Ｔ－ｒａｐ－１。连接产物的纯化按照ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ试剂盒提供的操作方法进行。

将２ μＬ连接产物ｐＧＥＭ－Ｔ－ｒａｐ－１加入到５０ μＬ感受态细胞ＪＭ１０９中，冰浴３０ ｍｉｎ后，在４２ ℃水浴中热激９０ ｓ，再冰浴２ ｍｉｎ，加入预热好的ＬＢ培养液９５０ μＬ，于３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养１ ｈ，离心，弃上清液，留下２００ μＬ菌液均匀涂在含Ａｍｐ、ＩＰＴＧ和Ｘ－Ｇaｌ的ＬＢ平板上，３７ ℃条件下培养过夜。

１．２．６ 阳性转化子的ＰＣＲ法和酶切法鉴定 挑取白色菌落置于含Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基中。振荡培养过夜，按照质粒提取试剂盒操作流程从阳性转化菌中提取ｐＧＥＭ－Ｔ－ｒａｐ－１质粒，并对所提质粒进行ＰＣＲ鉴定，反应条件及ＰＣＲ产物检测方法同１．２．３。用ＥｃｏＲ Ｉ对ｐＧＥＭ－Ｔ－ｒａｐ－１质粒进行酶切鉴定。酶切体系：ｐＧＥＭ－Ｔ－ｒａｐ－１ ５ μＬ，１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，ＥｃｏＲ Ｉ １ μＬ，灭菌水１２ μＬ，总体积为２０ μＬ。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切情况。

１．２．７ 阳性克隆产物序列测定与比较分析 ＰＣＲ法和酶切法鉴定正确的阳性克隆质粒由宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定。将所测得的序列用ＢＬＳＡＴ软件分析核苷酸序列与ＧｅｎＢａｎｋ中序列的同源性。

２ 结果与分析

２．１ 目的基因的ＰＣＲ扩增结果

ＰＣＲ扩增兰州株牛双芽巴贝斯虫ｒａｐ－１，该基因长度为８４６ ｂｐ，ＰＣＲ反应结束后取反应产物３ μＬ在１％琼脂糖凝胶（含０．５ μｇ／ｍＬ溴化乙锭）中电泳，出现预期大小的目的条带，结果见图１。

２．２ 重组质粒的酶切鉴定结果

用ＥｃｏＲ Ｉ对重组质粒进行酶切后，取３ μＬ进行１％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切结果，电泳显示在３ ０００ ｂｐ附近和８００ ｂｐ附近都出现了明显的条带，说明ＥｃｏＲ Ｉ已将ｐＧＥＭ－Ｔ－ｒａｐ－１切成两段：ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ和ｒａｐ－１，表明成功地克隆了ｒａｐ－１基因（图２）。

２．３ ｒａｐ－１序列的测定与比较分析

克隆的ｒａｐ－１基因序列经宝生物工程（大连）有限公司测定，结果表明，将rａｐ－１基因与pGEM-T Easy Vector相连，插入的片段长度为846 ｂｐ。兰州株牛双芽巴贝斯虫的ｒａｐ－１与巴西株牛双芽巴贝斯虫的相应序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：Ｎｏ． ＡＦ０１４４８６．１）相比具有很高的同源性，同源性为９９．７４％。

３ 结论与讨论

本研究成功地克隆了兰州株牛双芽巴贝斯虫的ｒａｐ－１基因，该基因全长８４６ ｂｐ，与巴西株牛双芽巴贝斯虫的相应序列的同源性高达９９．７４％。

近几年，科学家在研究牛双芽巴贝斯虫侵袭红细胞时发现，位于虫体被膜上的表面蛋白质与宿主细胞结合之后才能完成虫体入侵红细胞这一过程［７］。

已有资料表明，牛双芽巴贝斯虫顶端复杂的细胞器可以直接导致宿主细胞的入侵以及虫体液泡［８］的形成和维持。棒状体在虫体入侵宿主细胞的同时被排出，对于巴贝斯虫属而言，棒状体的排出发生在红细胞入侵和虫体液泡形成的同时，并且在此过程中，棒状体很快溶解并消失。

牛双芽巴贝斯虫的Rａｐ－１在牛体内可引发免疫防御反应，Rａｐ－１在羧基端和氨基端分别有两个二态形的序列区域，氨基端１型（ＮＴ－１）存在于表面暴露的Ｂ细胞抗原决定簇中，羧基端１型（ＣＴ－１）存在于ＣＤ４＋Ｔ细胞抗原决定簇中［７］。

Ｈｏｔｚｅｌ等［９］在试验中采用墨西哥株ＪＧ－２９双芽巴贝斯虫体［１０］发现每一个基因都包含一个二态形的序列，在氨基端和羧基端分别编码氨基酸序列。

由此可见，Rａｐ－１对牛双芽巴贝斯虫来讲是一种非常重要的表面蛋白质，通过这种蛋白质的活动，牛双芽巴贝斯虫干扰宿主细胞的功能，一方面，牛双芽巴贝斯虫获得生存的机会，另一方面使宿主红细胞崩解，虫体进入下一阶段的生活史。

研究ｒａｐ－１基因及其编码的蛋白质已成为治疗和预防牛双芽巴贝斯虫病的一个焦点，中国尚未开展这方面的工作，本研究成功克隆了兰州株牛双芽巴贝斯虫的ｒａｐ－１基因，通过多次测序该基因存在突变，将其与ＧｅｎＢａｎｋ中巴西株牛双芽巴贝斯虫的ｒａｐ－１基因序列进行同源性比较，结果显示序列之间同源性高达９９．７４％，证明ｒａｐ－１基因是高度保守的，仅有两个碱基的突变。由核苷酸序列推导蛋白质序列发现此碱基突变为无义突变，其编码的蛋白质结构并未发生改变。

牛双芽巴贝斯虫ｒａｐ－１基因的克隆为该基因的表达及生物学功能研究奠定了基础。作为药物靶点［11，12］的Rａｐ－１的结构功能和远期的药物结合特性研究对研制治疗牛双芽巴贝斯虫病的主动靶向制剂具有重要意义。

参考文献：

［１］ 赵 刚，张继才．牛双芽巴贝斯虫病［Ｊ］．云南畜牧兽医，２０００（２）：４１－４２．

［２］ 周金林，沈 杰，王 权，等．牛双芽巴贝斯虫病的防制研究［Ｊ］． 中国兽医寄生虫病，１９９７，５（１）：７－１０．

［３］ ＰＥＲＫＩＮＳ Ｍ Ｅ． Ｒｈｏｐｔｒｙ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ ｏｆ ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａｎ ｐａｒａｓｉｔｅｓ［Ｊ］． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ Ｔｏｄａｙ，１９９２，８（１）：２８－３２．

［４］ ＭＣＥＬＷＡＩＮ Ｔ Ｆ， ＰＥＲＲＹＭＡＮ Ｌ Ｅ， ＭＵＳＯＫＥ Ａ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，１９９１，４７（２）：２１３－２２２．

［５］ ＭＣＥＬＷＡＩＮ Ｔ Ｆ，ＰＥＲＲＹＭＡＮ Ｌ Ｅ，ＤＡＶＩＳ Ｗ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｆｉｎｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｌｉｖｅ Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８７，１３８（７）：２２９８－２３０４．

［６］ ＭＡＣＨＡＤＯ Ｒ Ｚ， ＭＣＥＬＷＡＩＮ Ｔ Ｆ， ＳＵＡＲＥＺ Ｃ Ｅ，ｅｔ ａｌ． Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｒｈｏｐｔｒｉｅｓ［Ｊ］． Ｅｘｐ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，１９９３，７７（３）：３１５－３２５．

［７］ ＭＩＴＣＨＥＬＬ Ｇ Ｈ，ＢＡＮＮＩＳＴＥＲ Ｌ Ｈ． Ｍａｌａｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ［Ｊ］． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，1988，８（４）：２５５－３１０．

［８］ ＳＡＭ－ＹＥＬＬＯＷＥ Ｔ Ｙ． Ｒｈｏｐｔｒｙ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ：ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ［Ｊ］． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ Ｔｏｄａｙ，１２（８）：３０８－３１６．

［９］ ＨＯＴＺＥＬ Ｉ，ＳＵＡＲＥＺ Ｃ Ｅ，ＭＣＥＬＷＡＩＮ Ｔ Ｆ，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｍｏｒｐｈｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｒａｐ－１ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｒａｐ－１ ｌｏｃｉ ｏｆ Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１９９７，９０（２）：４７９－４８９．

［１０］ ＭＩＳＨＲＡ Ｖ Ｓ，ＭＣＥＬＷＡＩＮ Ｔ Ｆ，ＤＡＭＥ Ｊ Ｂ，ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５８ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，１９９２，５３（１－２）：１４９－１５８．

［１１］ 任百祥，周晓光． ＤＮＡ靶向药物作用机制及发展趋势［Ｊ］． 医药导报，２００３，２２（９）：６５１－６５３．

［１２］ 张志荣． 靶向分子治疗基础与靶向药物设计［Ｍ］． 北京：科学出版社，２００５． ４０－４５．

推荐访问： 克隆 序列 基因 贝斯 分析

---