固相萃取—高效液相色谱—荧光法测定人体尿液中单胺类神经递质

材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters e2695型高效液相色谱仪-荧光检测器（美国沃特世公司）；Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；微量注射器；固相萃取仪（美国色谱科）；CP 225D微量分析天平（德国赛多利斯）；Oasis HLB、Oasis WCX 、Oasis WAX固相萃取柱（美国沃特世公司）。

标准品：重酒石酸去甲肾上腺素（美国 Sigma公司），酒石酸肾上腺素（上海阿拉丁试剂有限公司），多巴胺盐酸盐（上海源叶生物科技有限公司），5-羟色胺盐酸盐（上海源叶生物科技有限公司）；甲醇（HPLC级，美国默克公司）；乙腈（HPLC级，美国默克公司）；盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸铵（分析纯，天津化学试剂有限公司）；乙酸钠（分析纯，上海化学试剂总厂所属上海试剂四厂）；乙二胺四乙酸二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水均为超纯水。

1.2 方 法

1.2.1 色谱条件

反相液相色谱柱Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；进样量为10 μL；荧光检测激发波长280 nm，发射波长340 nm；柱温为30 ℃；流动相及梯度洗脱程序如表1所示。流动相成分中缓冲液即为含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）的0.04 mol/L乙酸钠溶液（pH 4）。

1.2.2 样品的检测

1）样品预处理

取新鲜人体尿液2 mL，加200 μL 1 mol/L的盐酸溶液将尿液进行酸化处理，随后加入2.0 mL 0.5 mol/L的乙酸铵，混匀，超声5 min后，以5 000 r/min离心10 min。取上清液，经0.45 μm滤膜过滤，滤液于4 ℃冰箱保存待用。

2）样品制备

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化Oasis WCX固相萃取柱。取上述處理过的尿样4 mL上样，流量为1 mL/min，依次用2 mL 20 mmol/L乙酸铵-甲醇溶液、2 mL甲醇淋洗杂质，最后用5 mL含2%甲酸的乙腈水溶液（85∶15，ν∶ν）洗脱被分析物，流量为0.5 mL/min。所得洗脱液氮吹至近干，用初始流动相复溶至1.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，供HPLC分析。

1.2.3 标准溶液配制

准确称取EP、NE、DA和5-HT标准品各20 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加入0.01 mol/L的盐酸溶液，充分震荡使其溶解并定容至刻度，得质量浓度均为2 000 μg/mL的标准储备液，保存于4 ℃冰箱中。

1.2.4 标准曲线绘制

准确吸取EP、NE、DA和5-HT 4种标准储备液，用0.01 mol/L的盐酸溶液稀释为EP 30.0 μg/mL、NE 50.0 μg/mL、DA 50.0 μg/mL和5-HT 20.0 μg/mL的标准应用液。分别准确吸取标准应用液0.01，0.05，

0.30，1.00，2.00 mL于10 mL容量瓶中，初始流动相定容，用HPLC分析，绘制标准曲线。

1.2.5 测 定

取1.2.2方法制备的尿液上样，进行HPLC分析，保留时间定性，峰面积定量。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取条件的选择及优化

2.1.1 固相萃取柱的选择

固相萃取的效果取决于其填料类型[10]，本实验分别考察了亲水亲油平衡柱（Oasis HLB）、弱阳离子交换柱（Oasis WCX）和弱阴离子交换柱（Oasis WAX）对神经递质的萃取效果，结果见图1。表明4种单胺类神經递质在Oasis WCX柱有较好的保留，且回收率最高，杂质去除理想；Oasis HLB回收率次之，但干扰杂质去除不够理想；Oasis WAX回收率不理想。Oasis WCX柱为弱阳离子交换柱，可吸附带正电的分子。这4种神经递质极性比较弱，在中性条件下为不带电荷的分子，而在酸性条件下成为带正电荷的弱阳离子。

2.1.2 淋洗液的选择

尿样成分复杂，含有多种蛋白质和盐类化合物，会干扰目标化合物的洗脱，因此洗脱之前的净化步骤也很重要。本文考察了纯水、甲醇、5%氨水-水溶液、20 mmol/L乙酸铵-甲醇溶液4种不同溶剂作为淋洗液的去杂质效果，结果表明，先用2 mL 20 mmol/L乙酸铵-甲醇溶液，再用2 mL甲醇作为淋洗液时，能最大程度去除尿液中的尿酸及部分中性和碱性化合物的干扰，且对于4种单胺类神经递质在萃取柱有最大保留。

2.1.3 洗脱条件的优化

考察了2%甲酸-甲醇、2%甲酸-乙腈、含2%甲酸的乙腈-水（85∶15，ν∶ν）3种不同的洗脱溶液，结果如图2所示。结果表明用含2%甲酸的乙腈水溶液洗脱效率最高。洗脱液每次1 mL进行洗脱，当用量为5 mL时，4种单胺类神经递质已完全洗脱，因此，本实验采用5 mL含2%甲酸的乙腈-水溶液（85∶15，ν∶ν）作为洗脱液。

2.1.4 流量的优化

样品过柱流量也是优化目标化合物固相萃取效果必须考虑的因素，因本实验的目标样品为尿样，基于临床应用考虑和固相萃取柱的容量，样品体积一般不会大于10 mL，而较小的流量一般都会对回收率提高有积极影响，因此本实验选择流量为0.5 mL/min。

2.2 分离条件的优化

单胺类神经递质在水溶液中具有较高的溶解性，造成在一般反相色谱柱保留强度较弱[11]。为了提高稳定性和达到更好的分离效果，选择酸性溶液加入适量的有机相作为流动相。分别考察了乙腈和乙酸钠水溶液、甲醇和乙酸钠水溶液，发现甲醇和乙酸钠水溶液分离效果与峰形优于乙腈和乙酸钠水溶液，因此有机相选用了甲醇。为了减少溶液中金属离子的干扰加入了EDTA-2Na。

流动相的pH是离子对色谱分离的关键，4种单胺类神经递质在酸性条件下稳定性最佳，考察了流动相的pH 2.0～pH 4.0对样品出峰情况的影响，如图3所示，结果表明，在pH较小时峰分离不好，在pH 4.0时色谱分离效果最好，故选用pH 4.0的流动相分析。

2.3 色谱条件优化

分别考察了Waters XBridge C18柱、Waters Symmetry C18柱和Agilent C18柱分离效果，发现Waters XBridge C18柱和Waters Symmetry C18柱对于分离EP和NE效果不够理想。Agilent C18柱对分析物分离效果最好，因此选用此色谱柱。

选用紫外检测器，发现峰形过小，灵敏度太低，以致无法检出[12]。选用电化学检测器，发现其背景较高且基线波动较大，原因可能是其电极在分析过程中参与氧化还原反应，反应产物累积在电极表面使得检测灵敏度降低，低浓度分析物难以检出[13]。故改用荧光检测器，其基线平稳，选择性好，可有效分离分析物。用荧光检测器进行扫描，发现4种单胺类神经递质在激发波长和发射波长分别为280，340 nm附近有最大吸收峰，样品溶液杂质干扰小，检测灵敏度高，故定其为检测波长。尿液样品图谱与样品加标分离效果如图4所示。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围及方法检出限

采用外标法，配制不同质量浓度的标准溶液进样测定，以峰面积为纵坐标，样品质量浓度为横坐标作图，绘制标准曲线，以3倍信噪比计算4种单胺类神经递质的检出限，结果见表2。线性范围和检出限可以满足嗜铬细胞瘤等相关疾病诊断的临床需求。

2.4.2 方法的精密度和回收率

取健康人的混合尿，分别加入1，30，200 μL标准应用液，每一质量浓度平行制作5份，连续5 d，按1.2.2方法萃取净化后，氮吹至近干，用初始流动相定容至1.0 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析，每份测定3次，记录各种单胺类神经递质峰面积的平均值，代入当日标准曲线计算测得浓度，考察方法的日内精密度和日间精密度；将测得的各种单胺类神经递质色谱峰面积与相应质量浓度标准溶液直接进样测得的色谱峰面积对比，得方法的绝对回收率，结果见表3。日内、日间精密度对于嗜铬细胞瘤患者用药前后疗效对照具有重要的临床价值，绝对回收率满足了4种单胺类神经递质的检测要求。

3 结束语

本文通过对尿液样品前处理条件和色谱分析条件的优化，选择了最佳检测条件，实现了对尿中4种单胺类神经递质的同时测定，具有操作简便、灵敏度高、检出限低、线性范围宽、杂质干扰少及结果准确可靠的优点。因尿液基质复杂，尿中4中单胺类神经递质含量较低，将尿液样品经盐酸溶液酸化处理后，在4 ℃冰箱保存一周结果无显著变化，对于临床患者尿液留存有实际意义。本文选用的Oasis WCX固相萃取柱既能实现尿液中复杂干扰物的去除，又能实现待测物的完全保留和洗脱，实现了HPLC-荧光检测器对4种单胺类神经递质的完全分离检测，满足了尿中单胺类神经递质的分析测试要求。

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（编辑：莫婕）

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