大黄酸调控mTOR信号通路活性抑制肾小管上皮细胞自噬蛋白表达的分子机制

材料与方法

1.1 药物与试剂 大黄酸（用0.1 mol·L^-1NaOH配置成1 g·L^-1溶液）、雷帕霉素（用二甲基亚砜配置成100 μmol·L^-1溶液）购自美国Sigma-Aldrich公司；Dulbecco′s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12）培养基、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、青霉素链霉素溶液、Hank′s 平衡盐溶液（HBSS）购自美国HyClone公司；溴酚蓝（bromophenol blue，BPB）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）和BSA（bovine serum albumin）购自BioSharp公司；磷酸酶抑制剂（phosphatase inhibitor cocktail）和Chemi-Lumi One L发光液购自日本Nacalai公司；蛋白酶抑制剂、显影定影试剂盒购自碧云天公司；蛋白相对分子质量Marker购自美国Thermo Scientific公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自Millipore公司；兔抗大鼠哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）I/II抗体、兔抗大鼠mTOR抗体、兔抗大鼠磷酸化mTOR（phosphorylated-mTOR Ser2448，p-mTOR S2448）抗体、兔抗大鼠β-actin抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；X光胶片购自Kodak公司。

1.2 仪器 细胞培养箱（日本SANYO公司）；奥林巴斯CK40型倒置显微镜；Western blot设备（美国BioRad公司）。

1.3 细胞培养和干预措施 大鼠肾小管上皮细胞株（NRK-52E）由日本山梨大学分子信号教研室Kitamura教授惠赠。NRK-52E细胞从液氮中取出后，常规复苏，接种于细胞培养基（95%DMEM/F12+5%FBS，含1%青霉素链霉素溶液），置于细胞培养箱中进行培养（37 ℃、饱和湿度、5%CO2）；将细胞以2×105个/孔的密度铺板至12孔板中，按各个实验的不同时间点将培养基换成HBSS 1 mL，再分别添加大黄酸（5 mg·L^-1）和雷帕霉素（100 nmol·L^-1）进行干预。

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