山羊MC4R基因多态性与体质量性状的关联性分析

计划（编号：2018YFD0501902-03）。

作者简介：张 俊（1982—），女，江苏南京人，助理研究员，主要从事羊分子育种研究。E-mail：applepuding@163.com。

通信作者：曹少先，博士，研究员，主要从事动物遗传资源与育种研究。Tel：（025）84390352;E-mail：sxcao@jaas.ac.cn。

黑素皮质素受体-4（melanocortin receptor-4，MC4R）是动物下丘脑腹内侧核分泌的一类肽类物质[1]，是黑素皮质素受体家族5个亚型之一，它属于G蛋白偶联受体超级家族，为跨膜神经受体。在哺乳动物中，MC4R具有介导瘦素（leptin）的功能，是一个调节能量动态平衡的重要信号分子[2]。MC4R通过与其内源性配体黑素皮质素激素（melanocortin，MC）或刺鼠色蛋白（agouti protein，agouti蛋白）及其相关蛋白（agouti related protein，AGRP）相结合，从而在控制食欲和体质量稳态中起关键作用[3-4]。1993年，Gantz等首次克隆出人MC4R基因，并用荧光标记原位杂交法将其定位于人18号染色体上[5]。1997年，Huszar等首次利用基因敲除试验证明了MC4R基因缺失的小鼠出现肥胖、多食、胰岛素分泌过多等症状，提出了MC4R基因在采食量和能量平衡中具有重要作用[6]。此后，又有研究发现，MC4R对猪、牛、兔等家畜的背膘厚、日增质量和采食量等有重要影响，可作为选择动物生长性状的候选遗传标记。

张俊等的研究发现，波尔山羊MC4R基因存在C693T、A946C、C986T等3个多态性位点，其中在C693T、A946C处分别检测到CC、CT和AA、AC各2种基因型，不同基因型波尔山羊体质量差异不显著;C986T处检测到CC、CT和TT等3种基因型，CT型的6月龄体质量和日增质量均极显著高于CC型，CT型的周岁体质量和日增质量均显著高于CC型，表明MC4R基因C986T位点可以作为山羊体质量性状标记辅助选择的候选分子标记[7-8]。

目前，关于山羊MC4R基因多态性及与其生长性状关系的研究仍然较少，是否存在新的影响山羊生长性状的MC4R位点，以及已发现的位点基因型组合是否影响生长性状等均有待进一步研究。为此，本研究对山羊MC4R基因重新进行测序，寻找多态性位点，分析其多态性与山羊体质量性状的关联，联合前期报道的3个位点，分析基因型组合与山羊体质量性状的关联，为山羊生长性状的分子辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

用于本研究的163只波尔山羊及其体质量资料均由江苏省农业科学院六合动物试验基地提供。每只个体取耳组织样于冻存管中，置冰桶中带回实验室，-20 ℃保存备用。

1.2 组织DNA提取

采用酚-三氯甲烷抽提法提取组织样DNA[9]，并溶于TE Buffer中，-20 ℃保存备用。

1.3 MC4R基因扩增

根据GenBank中山羊MC4R序列（NM_001285591.1）设计引物。上游引物序列为5′-TCCAAGTGATGCCGACCAG-3′，下游引物序列为5′-CTGGGCACTGCTTCACATC-3′，预期扩增片段1 375 bp。PCR反应总体系20 μL，包含模板DNA 60 ng、10×缓冲液 2 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL、dNTP（10 mmol/L）0.4 μL、Taq聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 0.6 μL，添加灭菌双蒸水至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环;72 ℃延伸10 min。

1.4 突变位点测序筛选

将40只波尔山羊随机分成4组（n=10），每组10只个体的DNA等量混合构建DNA池，每个DNA池取60 ng为模板进行MC4R基因PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用宝生物工程（大连）有限公司试剂盒切胶回收纯化后，送上海英骏生物技术公司测序。

1.5 PCR-RFLP分析

1.5.1 MC4R基因片段的擴增 根据测序结果，设计1对引物扩增MC4R基因758 bp片段（NM_001285591.1，序列 379～1 136 bp），该片段包含A502G突变位点，基因型A位于BseJⅠ识别序列内。上游引物序列为5′-[JP9]AATCCAAGATGAACTCTACCCA-3′，下游引物序列为5′-[JP9]CAGGATGGTCAGCGTGAT-3′。PCR反应总体系为20 μL，含模板DNA 60 ng、10×缓冲液 2 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL、dNTP（10 mmol/L）0.4 μL、Taq聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 0.6 μL，添加灭菌双蒸水至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色检测扩增结果。

1.5.2 基因型的确定 采用BseJⅠ对PCR扩增产物进行酶切。酶切反应体系16 μL，含PCR产物5 μL、BseJⅠ（10 U/μL）0.5 μL、10×缓冲液1.6 μL、灭菌双蒸水8.9 μL，37 ℃酶切3 h。用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，EB染色，培清JS-780全自动凝胶成像分析仪进行成像分析。

1.6 数据分析

采用SPSS 16.0软件one-way ANOVA分析基因型、基因型组合间波尔山羊各月龄体质量差异。各月龄体质量以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 MC4R基因的扩增

对4组波尔山羊池DNA模板分别进行MC4R基因PCR扩增，在1 400 bp左右得到1条特异性条带（图1），与预期结果一致。

2.2 测序筛选多态位点

以4组波尔山羊池DNA为模板扩增得到的MC4R基因纯化后进行测序，新发现502 bp处A/G单碱基颠换（图2）。基因型A位于BseJⅠ识别序列内。

2.3 PCR-RFLP检测方法的建立

对163只波尔山羊样本进行PCR扩增，在750 bp附近得到1条特异性条带（图3），与预期结果一致。采用限制性内切酶BseJⅠ对PCR扩增产物进行消化，出现3种基因型，分别命名为GG、AG、AA基因型。GG基因型得到758 bp 1个片段（图4，泳道9）;AG基因型得到758、513、245 bp 3个片段（图4，泳道4、5、14），AA基因型得到513、245 bp 2个片段（图4，泳道1、2、3、6、7、8、10、11、12、13、15、16）。

2.4 基因和基因型频率在受试羊群中的分布

在163只受试波尔山羊中，共检测出3种基因型，AA型居多，占77.91%，AG型次之，占20.25%，GG型最少，占 1.84%（表1）;A基因频率占88.1%，为优势基因。

2.5 A502G位点的效应分析

由表2可知，在受检的波尔山羊群体中，AA基因型个体初生体质量、1周龄体质量显著高于AG基因型，1周龄体质量极显著高于GG基因型，2周龄、2月龄、3月龄体质量显著高于GG型，其他月龄体质量差异不显著。

2.6 MC4R基因4个位点的聚合效应分析

在受试波尔山羊中，A502G、C693T、A946C、C986T位点共存在8种不同的基因型组合，分别为AACCAACC型、AACCAACT型、AACTACCC型、AACTACTT型、AGCCAACC型、AGCCAACT型、AGCTACCC型和GGCCAACC型，其中聚合基因型AACTACTT型、AGCCAACT型和GGCCAACC型样本少于3个，不参与分析。由表3可知，AACCAACC型个体初生体质量显著高于AGCCAACC型，AACCAACT型个体周岁体质量显著高于AACTACCC型和AGCTACCC型，其余指标间无显著差异。

3 讨论

大量研究表明，MC4R基因在动物采食和能量平衡调控中起关键作用。人MC4R基因的突变可导致早期遗传性肥胖[10-11]，猪、兔、鸡、牛、犬等均已发现MC4R基因存在于与体质量性状相关的SNPs。如Kim等对数个猪品系的研究发现，MC4R基因第7跨膜功能域的1个G/A突变可引起猪膘厚、体质量和采食量的显著变化[12-14]。El-Sabrout等研究发现，MC4R基因突变对兔体质量有显著影响[15-17]。仇雪梅等研究发现，MC4R基因5′调控区和编码区上的4个突变对鸡的体质量、屠体性状有显著影响[18]。Cai等研究发现，MC4R基因C1069G突变显著影响18月龄牦牛的体质量和日增质量[19]。Song等研究发现，MC4R基因3′调控区的4个突变与湖羊45 d断奶体质量显著相关[20]。张轶博等研究发现，比格犬MC4R基因226 bp处的C/A变异与体质量显著相关[21]。目前，关于山羊MC4R基因多态性及与其生长性状关系的研究仍然较少，是否存在新的影响山羊生长性状的MC4R位点及基因型组合有待进一步研究。

本研究设计特异引物扩增波尔山羊MC4R基因序列，通过DNA池为模板PCR扩增MC4R基因，结合测序法筛选其在波尔山羊群体中的SNPs位点，在编码区中新检测到A502G单碱基颠换，且在波尔山羊群体中发现该位点存在3种基因型，将其与波尔山羊的体质量性状进行关联分析，发现AA基因型个体初生体质量、1周龄体质量显著高于AG基因型（P<0.05），1周龄体质量极显著高于GG基因型（P<0.01），2周龄、2月龄、3月龄体质量显著高于GG型（P<0.05），说明A基因对体质量的增加更有利。该单碱基颠换导致MC4R氨基酸序列1 168 V（异亮氨酸→缬氨酸）变化，推测可能影响MC4R蛋白功能，从而引起体质量表型变化。

研究表明，生长性状是由多基因控制的且存在互作作用，单个遗传标记效应相对较小，不同位点的聚合效应分析将更有利于提高标记辅助选择改良畜禽生产性能的效果。Wang等的研究发现，湖羊MC4R基因H1H3基因型组合的生产性能均高于其他基因型组合[22]。赵宪林等研究发现，藏羊MC4R基因H13H7双倍型的各个生长性状表现最优[23]。黄毅研究发现，鹅MC4R基因H3H3基因型组合的活质量、屠体质量、半净膛质量、胸肌质量与H4H4基因型组合的肝质量、肝体比、肝屠比和腹脂率显著高于其他基因型组合[24]。唐现文研究发现，黑羽番鸭MC4R基因的C645T和G672A等2处基因型组合对公鸭活体质量和屠宰性能均有显著影响[25]。本研究发现，山羊MC4R基因C693T、A946C、C986T、A502G等4个位点在受检波尔山羊群体中存在8种基因型组合。单因素方差分析表明，AACCAACC型个体初生质量显著高于AGCCAACC型，AACCAACT型个体周岁体质量显著高于AACTACCC型和AGCTACCC型，其余指标间无显著差异。由于AACTACTT型、AGCCAACT型和GGCCAACC型样本少于3个，无法进行差异显著性分析，因此还须扩大样本数，进一步研究这些基因型组合与生产性能的关联性，以全面了解不同基因型组合的效应，为更好地利用基因型组合进行生长性状的辅助选择奠定基础。

4 结论

MC4R基因是畜禽经济性状的重要候选基因，在哺乳动物的体质量和体长调控中发挥重要作用。本研究发现MC4R基因的A502G位点A基因对山羊早期体质量增加更有利，基因型组合AACCAACT对山羊周岁体质量增加更有利，可以作为山羊生长性状选择的候选分子标记。

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