α—细辛脑长循环脂质体冻干工艺的研究

摘 要：采用乙醇注入法制备[α]-细辛脑长循环脂质体，以冻干后的外观和再分散性作为筛选冻干保护剂的评价指标，确定以蔗糖和甘露醇联用作为冻干保护剂，两者的配比为糖∶醇=3∶7，总含量为20%.以冻干率为评价指标，通过正交试验对冻干工艺参数进行优化，确定冻干曲线中预冻温度为-50 ℃，预冻时间为9 h；升温时间为9 h；主升华干燥温度为-30 ℃，维持12 h，压力为15 Pa；之后以5 ℃/h的速度升温；解析干燥温度为35 ℃，维持5 h，压力为10 Pa.制备的α-细辛脑长循环脂质体冻干工艺重复性、稳定性好，生产可行性高.

关键词：真空冷冻干燥；α-细辛脑；长循环前体脂质体；正交试验；冻干工艺

中图分类号：TQ460.7 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2018.04.009

0 引言

α-细辛脑（α-asarone，ARE）是天南星科植物石菖蒲中的主要成分之一[1].细辛脑具有缓解患者临床症状，改善肺部通气功能，促进痰液排出，减轻气道黏膜充血水肿并保护气道黏膜等作用[2].但由于α-细辛脑自身脂溶性很强，水溶性很差，普通制剂的生物利用度很低，严重影响其疗效的发挥，如细辛脑胶囊剂和片剂的绝对生物利用度仅为2.73%和5.56%[3-4].脂质体作为新型药物载体，在改善药物溶解速率，增强药物靶向性、缓释性、低毒性等方面具有良好的效果[5].在普通脂质体基础上加入高分子材料聚乙二醇（PEG）来改变脂质体表面亲水性亚结构，形成表面有高分子材料包裹的脂质体，以减少网状内皮系统对脂质体的吞噬吸收从而延长药物在体内的循环时间，通过这种方式增加药物在体内的释放时间提高疗效以及减少不良反应的发生[6].但是脂质体混悬液稳定性较差，贮存时间较短，在储存过程中存在聚集、融合、药物泄露、水解、氧化等问题[7-8]，用冷冻干燥法制得的冻干脂质体能够降低磷脂和药物的氧化速度，显著提高稳定性[9]，便于贮存和运输.因此，本文以乙醇注入法制备α-细辛脑长循环脂质体，通过冷冻干燥技术将脂质体制备成前体脂质体，先对冻干保护剂进行了筛选，再通过正交试验优化冻干工艺，并对其质量进行评价.

1 仪器与材料

1.1仪器

申辰BT100N型蠕动泵；予华DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；江南XS-213光学显微镜；HANGPING FA2204B电子天平；雷磁PHS-2F pH计；安捷伦 1260 Infinity 高效液相色谱仪；LGJ-15D四环冷冻干燥机；德国IKA GENIUS 3漩涡混匀器；马尔文Zetasizer Nano-ZS90 纳米粒度仪；德国IKA T18高速分散匀质机.

1.2 材料

Sephadex G-50（上海源聚生物科技，进口分装）；α-细辛脑原料药（广西亿康药业，批号：150506，纯度：98.6%）；大豆磷脂 Lipoid S 100（德國Lipoid公司，批号：579010-1150055-13，磷脂含量[≥]94%）；胆固醇（上海蓝季科技，批号：100918）；Vit E（武汉银河化工，批号：20091015）；聚乙二醇Lipoid DSPE-PEG-2000（德国Lipoid公司，批号：588200-2150067-01）；甲醇（天津科密欧，色谱纯）.

2 方法与结果

2.1 脂质体的制备[10]

用乙醇注入法制备α-细辛脑长循环脂质体，按处方量精密称取大豆磷脂、胆固醇、聚乙二醇（PEG-2000）和α-细辛脑原料药，加入适量恒温无水乙醇，搅拌使其完全溶解，用微量注射器将无水乙醇溶液慢慢匀速注入55 ℃水浴恒温的PBS 缓冲液（ pH = 6.8 ）中，搅拌30 min，加热50 min，尽量将乙醇挥发尽，水浴放置1 h使其充分水合，用高速分散匀质机匀质30 min，密封3 ℃下避光保存，即得 α-细辛脑长循环脂质体.

2.2 脂质体包封率测定[11]

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Hypersil（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（65∶35，v/v）；检测波长：313 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 mL.

2.2.2 标准曲线的确定

精密称取α-细辛脑10 mg，置于100 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得α-细辛脑贮备液；精密量取该贮备液0.4、0.7、2.1、3.5、4.9、6.3、7.0、8.0、9.0 mL分别置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀.分别取上述溶液按照2.2.1方法进行液相色谱分析，以峰面积（A）对质量浓度（C）进行线性回归，得线性方程A=45.364C-69.668，R=0.999 9.结果表明：α-细辛脑在4～90 mg/mL检测质量浓度范围内与峰面积积分值线性关系良好.

2.2.3 凝胶柱分离测定长循环脂质体中包含的药物

Sephadex-G50色谱柱（1.6 cm×50 cm）先用pH6.8 PBS平衡好，吸取1 mL长循环脂质体混悬液，用pH6.8 PBS洗脱，流速为 1.0 mL/min.收集带有乳光的洗脱液，用适量甲醇破乳至完全澄清，按“2.2.1”条件测定脂质体中ARE的含量.

2.2.4 包封率测定

精密量取α-细辛脑长循环脂质体1 mL，加入一定量的甲醇破乳，待溶液完全澄清透明后用流动相稀释至一定浓度，按“2.2.1”条件进行测定，求出脂质体中α-细辛脑的总含量.精密量取α-细辛脑长循环脂质体混悬液1 mL，按“2.2.3”项下的条件进行试验，测定脂质体中α-细辛脑的含量.按下式计算包封率[12]：包封率（%）=（W包/W总）×100%（W总——总药物量，W包——包入脂质体的药物量）.

2.3 α-细辛脑长循环脂质体冻干工艺的研究

2.3.1 冻干保护剂初步筛选

为保证冻干后能保持原有体积不变，冻干制剂不出现塌陷与皱缩，复溶再分散性良好，并保证冻干后包封率和粒径保持一定水平，在冻干前需要加入冻干保护剂.本文考察了蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇和甘氨酸等不同冻干保护剂对所制备的脂质体冻干样品的影响.因为冻干保护剂要为膜材磷脂质量的2倍以上才能取得较好的冻干效果，冻干保护剂的浓度越大冻干效果越好.但若冻干样品的浓度太大，冻干品表面会产生皱缩、起皮和开裂，冻干样品的固含量维持在4%～25%之间最为合适.由于脂质体的膜材已接近5%，因此固定冻干保护剂的总含量为20%.按处方量称取保护剂置于西林瓶中，用1 mL去离子水超声溶解后，加入1 mL α-细辛脑长循环脂质体混悬液，振荡混匀，液面高度大致1 cm，经过初步冻干后，以冻干后脂质体样品的外形、色泽以及冻干品的再分散性对冻干工艺进行评价.其中以冻干样品表面塌陷萎缩、脱离瓶壁、颜色变深、空洞或起泡记为<60分；以略有塌萎缩、颜色不均匀、表面起壳呈皲裂状记为60～70分；以体积饱满、颜色洁白均一、表面开裂起皮记为70～80分；以体积饱满、表面光洁平整、颜色洁白均一，呈疏松粉饼状者为最佳记为>80分.结果见表1.

结果表明：甘露醇为保护剂时冻干产品颜色洁白、体积较饱满、整体较平整细腻，但再分散性较差，而且在显微镜下观察，冻干后的脂质体粒径较大，有药物晶体析出；用蔗糖作为保护剂则再分散性较好，在显微镜下观察冻干前后脂质体粒径无明显变化，但成形不好，所得的冻干制品严重萎缩.经过预实验初步筛选，确定以甘露醇和蔗糖联合使用作为冻干保护剂.

2.3.2 冻干保护剂配比的筛选

蔗糖作为冻干保护剂常用的浓度为2%～5%；甘露醇常用的浓度为1%～10%，当蔗糖∶甘露醇≤2∶7，冻干品虽成形性好，但再分散性差，且在显微镜下观察有较多药物晶体析出；蔗糖∶甘露醇≥7∶3，冻干品颜色会变黄，且不能很好的成形.綜合以上因素，考察蔗糖与甘露醇联用为冻干保护剂时两者配比分别为3∶7、4∶6、5∶5、6∶4，经初步冻干后，结果见表2（外观评分标准见2.3.1）.

结果表明，蔗糖与甘露醇配比为3∶7和4∶6无明显差别，但由于甘露醇含量高导致分散性较差.因此，本次试验选择的冻干保护剂的配比为蔗糖∶甘露醇=4∶6.

2.3.3 冻干工艺的考察

选用L9（34）正交表[13-14]（见表3），以预冻温度和时间（A）、升温时间（B）、主升华干燥温度和压力（C）、解析干燥温度和压力（D）为影响因素，以冻干率作为考察指标进行试验.

冻干后脂质体样品冻干率是物料冻干后脱水质量占物料水分总量的比例，冻干率%=100%-水分含量%，水分含量用干燥失重法进行测定.正交试验结果见表4.

表4显示，RB>RA>RD>RC，即升温时间为主要影响因素，预冻时间为次要影响因素.由于ⅢA>ⅡA>ⅠA；ⅢB>ⅡB>ⅠB；ⅠC>ⅡC>ⅢC；ⅢD>ⅠD>ⅡD，因此得出最佳冻干工艺为A3B3C1D3，即预冻时间为9 h，温度为-50 ℃；升温时间为9 h；主升华干燥温度为-30 ℃，压力为15 Pa；解析干燥温度为35 ℃，压力为10 Pa.

2.4 α-细辛脑长循环冻干脂质体的质量评价

按照最优处方及最佳冻干工艺制备3批α-细辛脑长循环冻干脂质体，分别对其包封率、水分、粒径和Zeta电位进行考察，其结果如表5所示.

检验结果显示：3批冻干样品外观均为饱满洁白的疏松粉饼状物质，复溶后的脂质体溶液与未冻干脂质体溶液外观之间无差异，且3批样品之间的含水量、包封率、粒径和Zeta电位并无明显差异.证明该冻干工艺重复性好，在生产上具有可行性.

3 讨论

1）脂质体的冻干过程中必须使用冻干保护剂以降低冻干和水化过程对脂质体的损害，使脂质体的冻干制剂能够有良好的外观和再分散性，同时维持脂质体的包封率和粒径，保证脂质体的药效.本次研究发现蔗糖的冻干保护作用要优于海藻糖和乳糖，且具有良好的复溶再分散性，但其塌陷温度低（-32 ℃），也即主升华干燥温度低，冻干效率低；赋形剂中冻干效果最佳的是甘露醇，其完全没有吸湿性，而且塌陷温度高（-1.5 ℃），能够降低水的结晶速度，达到良好的支撑效果，保证冻干制剂外观饱满，但是甘露醇复溶再分散性较差.本次研究选用甘露醇和蔗糖为联合保护剂可互补缺点，保证冻干粉外观及复溶后的理化性质.

2）导致冻干制品出现如孔洞、塌陷、干缩、鼓泡和颜色变深等缺陷的原因有很多，其中主要原因有：①预冻时间太短，制品尚未完全冻结，在这种情况下开真空升华，外部压力迅速降低，就会引起鼓泡甚至喷瓶；②主升华干燥温度过高会导致制品溶化挥发，最后呈萎缩状态；③部分制品未完全干燥，如果加热过猛会出现熔化，而已干部分的固体物质会再溶解，这样也会造成冻干品塌陷.因此，预冻阶段必须保证样品完全冻牢，即预冻温度需低于样品的共晶点温度10 ℃～20 ℃，且预冻时间要足够长；并且在主升华干燥阶段必须控制好隔板温度，在该阶段下的制品温度不能超过样品的共熔点温度；冻干过程的真空度不能太低也不能太高，太高不利于传热，太低不利于水分蒸发，应保持在10～15 Pa左右.

3 ）本次试验研究了α-细辛脑长循环脂质体冻干剂的制备工艺，包括冻干保护剂的选择和冻干工艺的确定，通过正交试验分析了不同因素对α-细辛脑长循环脂质体冻干制剂质量的影响，选择-50 ℃作为预冻温度，保证了药液能完全冻结；升华干燥采用的是阶段式升温，对冻干制品的质量进行检查.通过冻干剂联合使用，在保证成品外观形状等物理指标方面均一性好的情况下，也保证了成品加入溶剂后可迅速完全溶解.通过把α-细辛脑长循环脂质体制备成冻干品，提高其稳定性，易于保存与运输.制得的成品为白色疏松粉饼状物质，平均粒径为200 nm左右，各项指标均较优，冻干工艺合理且重复性佳，实现了试验设计的目的，此项工作为制备α-细辛脑长循环前体脂质体提供了理论依据.

参考文献

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Study on freeze-drying process of the long-circulated lyophilized liposome

of α-asarone

CHEN Ying1， WU Shanguang2， YE Juan1， CHEN Yanting1

（1.Guangdong Food and Drug Vocational College， Guangzhou 510520， China；2.Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract： α-asarone liposomes were prepared by ethanol injection. The appearance and redispersibility of freeze-dried α-asarone liposomes were selected as evaluation indexes for lyophilization protectant，the combination of saccharose and mannitol was used as a freeze-drying protective agent. The cryoprotective was 20% saccharose-mannitol （3∶7） and the optimum process of freeze-drying was： pre-freeze for 9 h at -50 ℃，the heating-up time was 9 h； primary-drying for 12 h at -30 ℃，vacuum was 15 Pa； the temperature of desorption was 35 ℃ and maintaining 5 h，vacuum was 10 Pa. Stable α-asarone long-circulated lyophilized liposome could be obtained by screening cryoprotectives and optimizing freeze-drying process parameters and the physicochemical characters were good. The confirmatory test has proofed the feasibility and stability of the process.

Key words： vacuum freeze-drying technology； α-asarone； long-circulated lyophilized liposome； orthogonal test； freeze-drying process

（学科编辑：黎 娅）

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