石墨烯及其衍生物的抗菌性研究进展

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摘要：该文主要介绍近年来关于石墨烯及其衍生物在抗菌性方面的应用研究进展，包括石墨烯及其衍生物的抗菌性，抗菌性的测定方法对比，以及生物安全性评估等内容。研究表明：石墨烯及其衍生物具有良好的抗菌性和生物相容性，同时也是抗菌活性物质的理想载体。通过剂量调控和化学修饰可以保持石墨烯的优越性，同时又避免其诱发生物毒性，拓宽其在生物医学工程领域的研究与应用。

关键词：石墨烯；氧化石墨烯；抗菌性

文献标志码：A

文章编号：1674-5124（2015）03-0008-06

0 引言

利用抗菌剂来抑制和杀灭有害细菌是提高人类健康水平的一个重要方法，传统的抗菌剂，如抗生素、季铵盐等不但会导致微生物的抗药性，还会造成严重的环境污染。2010年，中国科学院上海应用物理所黄庆课题组首次发现了石墨烯材料的抗菌作用，即氧化石墨烯可以破坏细菌的细胞膜，导致胞内物质外流并杀死细菌。由于这是一种潜在的没有耐药性的物理“抗生素”，该工作发表后立即引起了科学界的广泛兴趣，之后，越来越多的研究证实了这点。但也有研究发现氧化石墨烯可以提高细胞的生长能力，促进细菌的生长。基于此，本文综述了近年来关于石墨烯及其衍生物在抗菌性方面的研究进展，主要包括石墨烯及其衍生物的抗菌性，抗菌性的测定方法对比，以及生物安全性评估等内容，以期为石墨烯及其衍生物在抗菌材料方面的研究应用提供参考。

1 石墨烯及其衍生物

2004年，英国曼彻斯特大学物理学家安德烈·海姆（andre geim）和康斯坦丁·诺沃肖洛夫（konscantinnovoselov）将石墨薄片的两面粘在一种特殊的胶带上，撕开胶带把石墨片一分为二。不断重复上述操作，薄片越来越薄，最后成功地得到了仅由一层碳原子构成的薄片一石墨烯，并因此获得2010年的诺贝尔物理学奖。石墨烯是由碳原子以sp"杂化连接的单原子层构成的新型二维原子晶体，其基本结构单元为有机材料中最稳定的苯六元环，它可以被看做是构成零维的富勒烯、一维的碳纳米管及三维的石墨和金刚石的基本结构单元（图1）。单层石墨烯的厚度仅为0.35nm，是世界上已知最薄的二维材料，具有丰富而奇特的物理化学特性，如石墨烯的比表面积高、导热性和力学性能突出、电子传递性能非凡，并具有一定的抗菌活性，可应用在电子、信息、能源、物理学、生物医药和材料学等领域，具有广阔的应用前景。然而，由于石墨烯化学稳定性高，结构完整，较难与其他介质发生相互作用，并且其片层之间的范德华力较强，所以石墨烯不能分散于水和常见的有机溶剂中，限制了其在生物医学领域的发展和应用。因此，人们主要通过物理或者化学方法对石墨烯进行改性，提高其溶液分散性。氧化石墨烯（graphene ox-ide，GO）就是石墨烯改性的代表衍生物之一。氧化石墨烯一般由石墨经强酸氧化而得。主要有3种制备氧化石墨的方法：Brodie法、Staudenmaier法和Hum-mers法，其中Hummers法是目前最常用的一种。氧化石墨烯与石墨烯的结构基本相同，只是在单层碳原子结构的基面上连接有大量的含氧基团（见图2），平面上含有-OH和C-O-C，而在其片层边缘含有C=O和COOH。与石墨烯相比，氧化石墨烯具有良好的润湿性能和表面活性，而且能被小分子或者聚合物插层后剥离，在改善材料的热学、电学、力学等综合性能方面发挥着非常重要的作用。与以往的碳基材料相比，氧化石墨烯具有以下特点：1）氧化石墨烯具有单原子层结构，良好的亲水性使其能够在水中完全分散为单层，意味着它具有更大的比表面积和表面活性与其他介质材料结合；2）修饰的氧化功能团提高了氧化石墨烯的表面活性，它们能够直接与介质材料发生静电吸附或键合作用，从而获得稳定的复合结构；3）氧化石墨烯具有类似于表面活性剂分子的自组装能力，能够在平整的固体表面自组装形成具有多层结构的连续的纸状薄膜；4）氧化石墨烯的原子层骨架具有良好的机械强度，可以起到机械支撑作用；5）与以往常采用的碳纳米管相比，氧化石墨烯价格便宜、制备简单，适合大规模生产。

2 石墨烯及氧化石墨烯的抗菌性

目前，石墨烯材料的抗菌性研究主要分为两个方面。一方面是石墨烯和氧化石墨烯本身的抗菌活性研究。2010年，中国科学院上海应用物理所黄庆课题组首先报道了石墨烯在抗菌材料方面的研究。他们发现，氧化石墨烯悬液在与大肠杆菌孵育2h后抑制率达到90%以上，其抗菌性来源于氧化石墨烯对大肠杆菌细胞膜的机械切割破坏。另外，通过真空抽滤法将氧化石墨烯制备成肉眼可见的片状石墨烯膜，也能有效地抑制大肠杆菌的生长。Zhao等采用辐射接枝的方法将氧化石墨烯连接到棉布上制备了氧化石墨烯基抗菌棉织物，并测定其抗菌性。研究结果表明氧化石墨烯基抗菌棉织物表现出很强的抗菌性，抑菌率大于98%.且这种棉织物在被洗涤100次后抑菌率依然保持在90%以上。Akhavan等分别采用革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）对沉积在不锈钢基质上的氧化石墨烯纳米墙（graphene oxide nanowalls）和石墨烯纳米墙（graphene nanowalls）的抗菌性进行了研究，发现氧化石墨烯和石墨烯对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有良好的抗菌性能；石墨烯抗菌能力更强，可能是由于还原过程增加了石墨烯的锐度，增强了其与细菌之间的接触切割作用。Liu等研究了氧化石墨烯和还原氧化石墨烯（rGO）对大肠杆菌活力的影响，发现GO的抗菌能力高于rGO，大尺寸的GO比小尺寸的GO拥有更好的抗菌性。同时，研究发现氧化石墨烯和还原氧化石墨烯都可以氧化细菌体内的还原型谷胱甘肽。因此认为材料的抗菌性除了来自对细胞膜的破坏外，还可能来自材料引发的氧自由基进而诱发的氧化损伤。其抗菌性可能存在以下3个环节：首先细菌黏附在材料上，然后石墨烯通过尖锐的边角切割细胞膜，接着超氧离子介导氧化应激最终导致细菌死亡。Krishnamoorlhy等研究证实了石墨烯可以通过脂质过氧化作用进行抗菌，间接说明了石墨烯的抗菌性可能与其氧化损伤相关。2013年Tu等提出了一种新的石墨烯抗菌机理，他们认为，石墨烯不但可以通过接触切割作用对细菌细胞膜进行破坏，还可以通过大规模的直接抽提细胞膜上的磷脂分子，来破坏细胞膜并杀死细菌。该研究将理论模拟和实验结果相结合，计算机分子学模拟指出石墨烯独特的二维结构使其可以与细菌细胞膜上的磷脂分子发生超强的相互作用，导致大量磷脂分子脱离细胞膜并吸附到石墨烯的表面（见图3）。透射电子显微镜实验直接观察到了细菌细胞膜与氧化石墨烯作用后产生的大范围空腔结构（见图4），为理论计算结果提供了实验证据。这种提取细胞膜脂类分子从而杀死细菌的分子机制很好地诠释了石墨烯基纳米材料的抗菌机理及细胞毒性原理。张欢对3种不同尺寸的氧化石墨烯（205.8，146.8，33.78nm）的抗菌性研究结果显示，氧化石墨烯与细菌细胞膜发生的这种脂类分子提取作用和GO的片层尺寸相关，尺寸越大，作用越强，抗菌性也越好。

石墨烯抗菌性研究的另一方面是氧化石墨烯负载银的抗菌活性研究，以及氧化石墨烯与其他材料复合后的抗菌性研究。Zhu等采用静电自组装技术将纳米银颗粒负载到氧化石墨烯上制备出了GO-Ag复合材料，抗菌实验结果表明，GO-Ag复合物对革兰氏阴性菌一大肠杆菌的最小抑菌率（MIC）为3.2μg/mL，而纳米银颗粒对大肠杆菌的最小抑菌率为6.4μg/mL，同样，GO-Ag复合物对革兰氏阳性菌一枯草芽孢杆菌的最小抑菌率（MIC）为6.4μg/mL，而纳米银颗粒对枯草芽孢杆菌的最小抑菌率为9.6μg/mL，说明GO-Ag复合物具有更好的抗菌性。Liu等的研究也发现当GO-Ag质量浓度为80μg/mL时，GO-Ag复合物对大肠杆菌的抑菌率可达到99%，远高于同浓度时GO的抑菌率（10%）和纳米银的抑菌率（86%）。当材料质量浓度提高到100μg/mL时，GO的抑菌率（17%）和纳米银的抑菌率（96%）也不及GO-Ag复合物质量浓度仅为80μg/mL时的抑菌率（99%）。类似的研究均发现纳米GO-Ag；复合材料具有更好的抗菌性。此外，Lim等将GO、rGO分别与壳聚糖进行复合后测定其复合物的抗菌性，结果表明GO或rGO与壳聚糖复合后并不影响其自身的抑菌作用，由于GO与壳聚糖有协同抗菌作用，使得复合物的抗菌能力优于同浓度下GO或rGO的抑菌率。Santos等将聚乙烯咔唑连接到GO上形成新型复合物，其抗菌性研究结果也得出了类似的结论，这说明石墨烯材料在复合过程中依然保持了其抗菌特性，在涂料、包装、抗菌织物和医用材料中具有广阔的应用前景。专利CN10397595IA介绍了一种氧化石墨烯/银络合抗菌材料，该发明将银与有机或无机络合物结合形成小分子，再结合氧化石墨烯来增强其稳定性，并通过缓释性来延长抗菌性能，提高了氧化石墨烯银系抗菌材料与其他助剂同浴时的稳定性，还降低了银系抗菌材料的成本，具有高效、无毒、环保的优点。专利CN103651564A以氧化石墨烯溶液和青霉素阴离子捅层水滑石胶体溶液的混合液为原料，用溶液浇铸法制备得到了氧化石墨烯/水滑石抗菌纳米复合薄膜材料。将该纳米复合薄膜暴露在新培养的溶壁微球菌溶液中24h后，薄膜表面几乎没有细菌附着，只有少量的细菌代谢产物，表明复合薄膜具有良好的抗菌性能。专利CN103191464A介绍了一种抗菌多孔氧化石墨烯/壳聚糖复合支架的制备方法。该方法以羧基化的氧化石墨烯为抗生素载体，利用氧化石墨烯表面的羧基与抗生素上的氨基发生静电作用将抗生素吸附到氧化石墨烯上；再将抗菌金属离子螯合在壳聚糖分子中，最后把载有抗生素的羧基化石墨烯和载有抗菌金属的壳聚糖溶液混合，冷冻干燥，得到载有两种不同抗菌材料的复合支架。该复合支架能在短期内释放抗生素以及长期释放抗菌金属离子，兼顾了短期抗菌与长期抗菌作用，抗菌效果好。

3 石墨烯抗菌性的测定方法比较

在微生物学中，抗菌剂的抗菌效果通常是通过检测微生物在抗菌剂作用前后数目的变化来表示。常用的方法有平板菌落计数法、光电比浊度法、显微镜直接计数法、膜过滤法等。吕敏等采用光电比浊计数法、抑菌环法和平板菌落计数法对比测定了GO的抗菌效果。结果显示抑菌环法和光电比浊计数法测定的GO无抗菌性，而平板菌落计数法测定的GO有明显的抗菌性，抑菌率约80%。他们认为抑菌环实验法测定GO的抗菌性时，因GO不具有溶解性，其悬液滴加在滤纸上时GO不能扩散，无法杀死滤纸边缘的细菌而形成明显的抑菌环；光电比浊法测定GO抗菌性时，由于其比表面积大，易吸附培养基中的蛋白质形成易于细菌生长的附着点，促进细菌的生长。因此，这两种方法都不能准确反映GO的抗菌效果；而采用平板菌落计数法测定GO抗菌性时，细菌与GO悬液充分接触，作用后的细菌数目通过平板计数直接反映出来，避免了其他干扰因素，能够客观准确地反映GO的抗菌效果。由此可见，使用不同的检测方法，同一种抗菌剂也会得出不同的实验结果。这就要求实验人员在进行抗菌性检测的时候，要根据抗菌剂的性质来进行合理选择。

4 石墨烯的生物安全评价

石墨烯及其衍生物在组织工程、药物载体、生物检测、生物成像等生物医学领域具有潜在的应用前景，但其生物安全性评价的研究还比较缺乏。Zhang等采用示踪技术研究了GO在小鼠体内的分布和生物毒性，发现GO血液循环时间长，网状内皮系统吸收低。当暴露在Img/kg GO下14d时，未发现明显的病理变化；当GO剂量提高到10mg/kg时，小鼠肺部会出现明显的病理性改变，提示高剂量的GO存在肺毒性。Zhang等研究发现，石墨烯对PC12细胞的代谢影响存在浓度依赖性，当石墨烯质量浓度低于0.01μg/mL时，细胞活性基本没有降低，可以用在载药、生物检测和治疗中。Wang等的研究也发现，GO对人成纤维细胞的毒性存在浓度依赖性。当GO质量浓度低于20μg/mL时，GO对细胞无明显毒性，当GO质量浓度大于50μg/mL时出现明显的细胞毒性，细胞存活率下降。Lu等也对GO的细胞毒性进行了研究，发现当GO质量浓度达到lOOmg/L时，细胞的相对存活率仍接近100%，说明GO细胞毒性较低。Kalbacova等研究了成骨细胞及间充质干细胞在石墨烯支架材料表面的细胞黏附及增殖能力，结果表明，石墨烯能够促进成骨细胞及间充质干细胞黏附及增殖，提示石墨烯片无细胞毒性，有望成为具有骨传导和骨诱导作用的骨移植物质。Zhang等的研究发现，同等质量浓度下，GO尺寸越小，其细胞毒性越小。Chang等的研究发现，3种不同尺寸G0（588，556，148nm）在质量浓度小于50μg/mL时，无明显的细胞毒性，但GO存在细胞氧化应激作用，高浓度可使细胞活性稍微降低。上述研究说明石墨烯对细胞活性的影响存在一定的浓度依赖性，并且随GO尺寸的减小细胞毒性随之降低。

Zhang等在氧化石墨烯的生物毒性、可控联合载药和靶向运输等方面进行了研究，结果表明，纳米GO可被细胞吸收但没有明显的细胞毒性，对一些芳香类的小分子药物具有超强的吸附能力，非常适合作为靶向药物载体，叶酸修饰的GO在质量浓度高达100μg/mL仍没有明显的细胞毒性。Yang等将聚乙二醇（PEG）修饰的GO注射到小鼠体内，发现GO主要沉积在网状内皮系统，在肺内未见到明显的炎症反应，并且纳米GO可以逐渐通过肝脏代谢。Ruiz等考察了胺基化的石墨烯对血小板活力的影响，结果显示胺基化的石墨烯不会引起血小板聚合，并且小鼠静脉注射后不会引起肺血栓栓塞。这说明石墨烯通过功能化修饰后可以降低其诱发的生物毒性，进而发挥石墨烯的抗菌性和生物相容性，具有更安全的生物医学应用。

5 结束语

本文总结了近年来关于石墨烯及其衍生物在抗菌性及生物安全性方面的研究报道，研究表明，石墨烯与细菌作用时表现出优异的抗菌性能，与细胞或生物体作用时只表现出微弱的细胞毒性，说明石墨烯是一种既具有抗菌性又具有良好生物相容性的纳米材料，在生物医学方面具有极大的应用潜力。石墨烯同时还是抗菌活性物质的理想载体，在开发新型抗菌材料方面有巨大潜力，但目前还只是针对石墨烯及其衍生物本身的抗菌活性和其他一些应用进行了初步研究。石墨烯的生物安全性研究虽然已经积累了一定的研究基础，但其生物效应和安全性数据目前还不是很充分，需要综合多方面的因素进行深入研究。此外，石墨烯与生物体相互作用的机制研究尚处于初级阶段，还有待进一步地深入研究。当然，石墨烯材料对生物体存在的潜在危害并不是绝对的，可以通过化学修饰和剂量调控保持石墨烯的优越性又避免其诱发生物毒性，使其更为安全、广泛地应用于各个领域，随着研究的不断深入，石墨烯材料将极大地造福于人类。

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