烟管菌T1原生质体制备及菌丝再生条件优化

材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株及主要试剂。烟管菌T1分离自南京紫金山[8]，溶壁酶购自广东省微生物研究所。

1.1.2培养基。PDA液体培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L；PDA固体培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L；PDA再生培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，KCl 0.55 mol/L；RM1再生培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KCl 0.55 mol/L；RM2再生培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏20 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KCl 0.55 mol/L。

1.2方法

1.2.1菌体培养。从保存的试管斜面上挑选菌丝接种于PDA固体培养基上，于28 ℃培养5 d，用接种环取出部分菌丝接种至PDA液体培养基中，28 ℃ 、150 r/min摇动培养。

1.2.2原生质体制备。取摇床培养3 d的真菌菌丝0.2 g，用无菌水洗涤2次，再用0.5 mol/L KCl洗涤2次，转移至0.5 mol/L KCl渗透压稳定剂配制的15 mg/mL溶壁酶中，30 ℃处理4 h，每隔1 h振荡1次，用血球计数板计数。

1.2.3原生质体制备条件优化。摇瓶培养时间为3、4、5、6、7 d的菌丝分别用于制备原生质体；分别选用0.5 mol/L KCl、MgSO4、甘露醇、蔗糖、山梨醇作为渗透压稳定剂进行筛选，得到最佳渗透压稳定剂，在此基础上筛选最适酶浓度、酶解时间及最适pH。

1.2.4原生质体再生培养基的选择。将配制好的原生质体用等渗液稀释至104 个/mL，分别取100 μL涂布在PDA再生培养基、RM1再生培养基、RM2再生培养基3种培养基上，以不含渗透压稳定剂的低渗培养基为对照，28 ℃培养，每组设置3个重复，计算再生率[4]。

X=B-C1A×100%

式中，X为再生率；A为原生质体数量；B为再生菌落数量；C为对照组菌落数量。

2结果与分析

2.1菌龄对原生质体得率的影响在温度28 ℃、pH 6.5、05 mol/L KCl渗透压稳定剂、15 mg/mL溶壁酶的条件下，分别酶解菌龄3、4、5、6、7 d的菌丝进行原生质体制备。由图1A可知，菌龄在3 d时原生质体数量最多，随后原生质体数量明显下降，而在第1天、第2天时由于菌丝体刚刚生长，菌丝量很少，不适合制备原生质体。

2.2渗透压稳定剂种类对原生质体得率的影响在3 d菌龄、其他条件不变的条件下，利用相同浓度的MgSO4、甘露醇、蔗糖、山梨醇分别代替KCl，分析不同种类渗透压稳定剂对原生质体得率的影响。由图1B可知，KCl作为渗透压稳定剂时，原生质体数量最多，山梨醇次之，甘露醇、蔗糖和MgSO4作為渗透压稳定剂时，原生质体数量较少。

2.3渗透压稳定剂浓度对原生质体得率的影响渗透压稳定剂浓度对原生质体得率及原生质体活力具有重要影响。渗透压稳定剂浓度过低时，原生质体容易破裂，而渗透压稳定剂浓度过高时，细胞容易发生质壁分离，且不利于原生质体的释放。由图1C可知，当渗透压稳定剂KCl浓度为0.5 mol/L时最优。

2.4pH对原生质体得率的影响pH也是影响原生质体数量的重要因素之一。由图1D可知，当pH为5.5时，原生质体数量最多，之后随着pH的升高而降低。

2.5酶浓度及酶解时间对原生质体得率的影响由图1E可知，向菌丝中加入10、15、20、30 mg/mL 溶壁酶后，浓度为15、20、30 mg/mL时，原生质体数量无显著差异，但均比10 mg/mL的高。由图1F可知，随着酶解时间的延长，原生质体数量逐渐增多，酶解时间3 h时原生质体数量最多，达118×106 个/mL。随着酶解时间的进一步延长，原生质体数量呈下降趋势。

2.6再生培养基种类对烟管菌T1菌丝再生的影响制备的原生质体在不同再生培养基上经过12～16 h静置培养，可长出细胞壁并萌发菌丝。分别以PDA再生培养基、RM1再生培养基、RM2再生培养基为基础，研究不同再生培养基对烟管菌T1菌丝再生的效果。由图2可知，RM1培养基中再生率最高，达1.22%，RM2培养基次之，PDA再生培养基的再生效果最差。

3结论与讨论

利用真菌菌丝体抑制并消除活体藻细胞是一种新型的真菌-蓝藻相互作用，烟管菌T1是笔者所在课题组前期分离获得的一株具有较强分解能力的抑藻真菌。唐黎等[11]利用烟管菌XX-2处理铜绿微囊藻废水，结果表明，烟管菌XX-2具有抑藻能力。任申荣[12]对烟管菌T1抑藻过程进行转录组分析，获得大量的差异分解酶基因，而制备大量高质量的原生质体是对该真菌抑藻关键基因功能进一步验证的前提和基础。

不同种类微生物细胞壁组成差异较大，因此制备原生质体的最佳条件也有较大差异。不同培养时间的菌丝，其细胞壁组成也有差异，老的菌丝细胞壁上沉积有不易被酶降解的物质，从而大大减少了原生质体的形成和释放，因此生长时间较短的幼嫩菌丝比较适合用于原生质体的制备[13]。烟管菌T1菌龄在3 d时原生质体数量最多，而云芝F21a在4 d时原生质体数量最多[4]。通过对其他参数进一步优化，原生质体产量达1.18×106个/mL，但比云芝F21a及古尼虫草小孢变种原生质体制备效果差[4，13]，而烟管菌T1再生率达122%，略高于云芝 F21a再生率（0.74%），这可能是由于不同菌株遗传背景差异造成的。该试验通过对烟管菌T1原生质体制备和再生条件进行研究，获得了该菌制备和再生的最佳条件，为进一步开展相关基因功能验证奠定基础。

参考文献

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[12] 任申荣.水体中烟管菌T1-蓝藻互作分子机制的初步研究[D].合肥：安徽农业大学，2016：39-47.

[13] 陈晓琳，樊美珍，李增智.古尼虫草小孢变种无性型原生质体制备及再生条件的研究[J].菌物学报，2005，24（4）：533-538.

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