补料发酵生产辅酶Ｑ10的研究

摘要：目的研究酵母菌HY-05发酵生产辅酶Q₁₀提高产量的方法。方法研究不同初糖浓度及补加方式，补加玉米浆和控制溶氧对酵母菌发酵过程中菌体量和辅酶Q₁₀产量的影响，确定辅酶Q₁₀补料分批发酵的最佳条件。结果酵母菌HY-05产辅酶Q₁₀的量达到156.2 mg/L，与不补料相比产量提高了58.1%。结论此法能提高酵母菌HY-05发酵生产辅酶Q₁₀的产量。

关键词：辅酶Q；补料分批发酵；条件优化

中图分类号：TQ922文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)06-0001-05

Studies on Fed-batch Fermentation of CoQ₁₀

XIAO Hai-rong，XU Ji-yang

（China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China）

Abstract：Objective To study the method of enhancing the yield of CoQ₁₀ by fermentation from yeast HY-05.Methods The effects of different initial sucrose concentration, feeding mode of sucrose, feeding of corn steep liquor and dissolved oxygen on some parameters, such as yield of CoQ₁₀, biomass of yeast, during the fermentation process of CoQ₁₀ were studied. The optimum condition of fed-batch fermentation of CoQ₁₀ was confirmed. Results Under these optimum condition, the yield of CoQ₁₀ reached to 156.2 mg/L, which were 58.1% higher compared with the fermentation without feeding sucrose and corn steep liquor. Conclusion This method can enhance the yield of CoQ₁₀ by fermentation from yeast HY-05.

Key words：coenzyme Q; fed-batch fermentation; optimal condition

辅酶Q₁₀别名癸烯醌、泛醌（ubiquinone），化学名称为2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌，作为细胞内代谢呼吸激活剂具有很高的临床应用价值，其微生物发酵生产法颇受关注。辅酶Q₁₀发酵过程中糖酵解（EMP）和戊糖磷酸（HMP）途径是辅酶Q₁₀生物合成代谢的主流途径[1]，不同的碳源、添加物、溶氧条件等会影响其代谢流量。研究表明，蔗糖是酵母菌HY-05发酵生产辅酶Q₁₀的较佳碳源[2]，但浓度过高会抑制辅酶Q₁₀合成。玉米浆中含有多种氨基酸、生物素、蛋白质等成分，可提供细胞生长所需的氮，并可作为辅酶Q₁₀合成的促进剂，但研究表明，玉米浆起始浓度过高不利于辅酶Q₁₀发酵[3]。我们通过补料分批培养方式较好地解决了此问题。本研究以红色酵母菌HY-05 作为出发菌株，优化流加补料发酵条件，得到了满意的结果。

1仪器与材料

HY-05菌种（中国药科大学生化教研室）；自动发酵罐（Bioengineering AG，瑞士比欧生物工程公司）；种子培养基（％）：蔗糖 2.0，蛋白胨 1.0，酵母粉1.0；（自然pH）；发酵培养基（％）：蔗糖4.0，蛋白胨2.8，KH₂PO₄ 0.13（pH =5.0）。

2方法

2.1种子培养

从活化斜面上挑取一环菌体接入种子培养基，28 ℃，240 r/min培养24 h。

2.2摇瓶培养

菌种在平板上28 ℃培养48 h 后，接入种子培养基（20 mL/250 mL 锥形瓶），28 ℃振荡培养24 h 后，以2%接种量接入发酵培养基（40 mL/500 mL 锥形瓶），26 ℃振荡培养72 h。

2.3分批培养

2.3.15 L发酵罐装液量3 L，接种量2％，发酵温度26 ℃，搅拌速度300 r/min。培养24 h后，按下述3种方式以20％蔗糖溶液流加补料培养，48 h时终止发酵。（1）恒速流加；（2）pH反馈流加；（3）线性递减流加在实际操作中，由于进料蠕动泵不能按Fi（t）计算值连续改变流加速率，因此，按文献[4]采用台阶式（间隔2 h）减少方式改变流加速率。

2.3.2考察发酵过程中pH的变化对提高辅酶Q₁₀产量的影响。

2.3.3考察玉米浆的不同添加时间和流加速率对产辅酶Q₁₀的影响。

2.4测定方法

2.4.1菌体生长测定培养液3 000 r/min 离心10 min，倾去上清液，用蒸馏水洗涤菌体2次，于105℃下烘干至恒重。

2.4.2蔗糖测定经盐酸水解按还原糖方法测定。

2.4.3辅酶Q₁₀含量测定皂化提取[5]，用高效液相色谱法（HPLC）检测。C18柱，流动相为无水乙醇，流速为1.00 mL /min，检测波长为275 nm，进样量20μL。

3结果与讨论

3.1酵母HY-05发酵生产辅酶Q₁₀的条件

考察培养液初始pH、发酵温度、培养液装瓶量等因素对菌体生长和产酶的影响，结果表明，该菌在初始pH 4.0~8.0之间虽都能生长和产酶，但pH 5.5~6.5较为适宜，且在此范围内发酵液中辅酶Q₁₀含量随pH降低而增大，见图1；在其他条件相同时，26 ℃时产酶水平最高；溶氧对菌体生长和产酶量也有较大影响，当500 mL摇瓶中培养液装量在40 mL时，产酶水平最高，见图2。

3.2蔗糖对HY-05发酵生产辅酶Q₁₀的影响

3.2.1初始蔗糖浓度的影响为提高生物量和产酶水平，本研究在摇瓶试验中，测试了初始蔗糖浓度对菌体生长和产酶的影响，结果见图3。由图1可见，初始蔗糖浓度在20~40 g/L 范围内，细胞量和产酶单位随初糖浓度增大而增加，达到40 g/L时有最大菌浓度（43.6 g/L ）和最大辅酶Q₁₀产量（98.8 mg/L），超过40 g/L时辅酶Q₁₀合成下降。可能是因细胞生长快，发酵液黏度加大，细胞溶解氧下降，影响了辅酶Q₁₀的合成，表明底物浓度适量可控制细胞的生长速率和辅酶Q₁₀的合成。

3.2.2HY-05的摇瓶发酵进程为建立5 L 罐发酵补料模式，首先实验分析了摇瓶发酵过程中的相关参数，如细胞生长量、pH、产酶水平及糖的消耗等。当发酵液中初糖浓度为40 g/L，底物消耗速率较高，细胞生长较快时辅酶Q₁₀的合成速率比较低[2]，细胞生长处于稳定期（35 h）时，辅酶Q₁₀的合成在继续进行，或者说，此时细胞内主要进行次级代谢产物合成，见图4。由图4可见用于维持细胞代谢的底物量较少，细胞生长对数期菌体利用碳源主要用于细胞生长。提示在补料培养中可用控制发酵后期补料来实现较高的细胞密度和辅酶Q₁₀发酵产量。 辅酶Q₁₀发酵过程中pH的变化曲线见图5。

由图5可见，发酵开始至25 h pH下降明显，此后逐渐上升，至48 h达到7.2左右，与文献[6]报道近似。测定发酵中间产物，发酵过程中产生的有机酸主要有乙酸、乳酸和丙酮酸，乙酸是前期pH下降的主要原因。乳酸含量在发酵全过程中不断上升，而丙酮酸含量先升后降，这2种有机酸产生量相对较少。在发酵中后期部分有机酸作为补充碳源不断消耗使pH逐渐升高。

3.2.3摇瓶补糖实验为提高产酶量，在摇瓶中进行了补糖试验。26 ℃发酵培养，从24 h起，每隔2 h补加0.050 ％~0.15 ％（w/v）蔗糖，共补糖5次，48 h后收集菌体，测定辅酶Q₁₀含量。结果表明，蔗糖补加量在0.050 ％~0.10 ％时与菌体生长和辅酶产量呈正相关，当每次补加量为0.10％时，生长和产酶量达到最高。每次补加量超过0.10％，细胞量和产物合成下降，见图6。比较不同补糖次数对菌体生长和产酶的影响，表明从发酵24 h起，每隔2 h补蔗糖0.10％，补糖6次为最佳，补加7~8次，细胞量和产物合成下降，见图7。

3.2.45 L发酵罐补糖模式的比较根据摇瓶补糖试验结果，发酵生产辅酶Q₁₀时缓慢补加蔗糖有助于菌体生长和产物的合成；补糖速度过快，因细胞生长加快，过高的细胞密度会使溶解氧浓度下降，抑制细胞的代谢活力，导致辅酶Q₁₀合成速率下降[3]。

恒速补糖：在发酵24 h时开始补加蔗糖。参考摇瓶试验结果将蔗糖的补加速度控制在0.5 g/(L·h) ，恒速连续补糖16 h，每升发酵液补蔗糖8 g 的条件下可得到最大的菌体量（39.8 g/L）和产酶量（106.0 mg/L），进一步补糖并不能使产酶和生物量继续升高。加快补糖速度产物合成会受到抑制，减缓补糖速度则会降低细胞的生长和产酶量，见图8。

pH反馈补糖：发酵初期pH 值下降至5.0以下时开始流加补糖，pH值会逐渐上升，高至7.2时，停止补糖。发酵全过程中补加的蔗糖为7.3 g/L 发酵液，最终菌浓是36.3 g/L，酶产量为112.6 mg/L，见图9。

线性递减流加：采用台阶式（间隔2 h）减少流加速率。初始流加速率为0.6 g/(L·h)，以0.05 g/(L·h)的速率递减，在速率为0.05 g/(L·h)时流加结束，发酵全过程中所补加的蔗糖为7.8 g/L。最终菌浓是38.6 g/L，酶产量为120.1 mg/L，见图10。

结果表明，恒速流加方式维持细胞生长较稳定，而产物生成较低；线性递减流加方式细胞的生长速率很快下降，底物积累较少，而产物合成速率较快，且维持时间较长； pH反馈流加，产物合成量介于上述两种方式之间。用线性递减流加蔗糖可保证发酵前期细胞的生长活力，发酵后期控制细胞生产速率适宜，可使细胞的生长和辅酶Q₁₀的合成相协调。

3.3流加玉米浆对辅酶Q₁₀发酵的影响

玉米浆中含有嘌呤类、硫氨素、苯丙氨酸、缬氨酸等多种成分，可作为辅酶Q₁₀合成的促进剂提高产物的合成。

3.3.1不同时间流加在发酵0，12，24 h添加5%玉米浆，结果见表1。由表1可见，添加适当的玉米浆能显著提高细胞生物量和辅酶Q₁₀的合成量，在发酵24 h后添加玉米浆可使辅酶Q₁₀的合成量达到121.5 mg/L。发酵初期添加玉米浆可能由于细胞密度过高反而不利于辅酶Q₁₀的合成。

3.3.2玉米浆的流加速率玉米浆浓度过高对辅酶Q₁₀发酵不利。在发酵24 h开始以7.0，7.5，8.0 mL/(L·h)的速度流加玉米浆，至44 h结束，结果见图11、图12。以7.5 mL/(L·h)的流加速度流加玉米浆可使辅酶Q₁₀的合成量达到最大为140.5 mg/L。玉米浆流加过量时细胞生长时间虽延长，但产物合成量并不增加，所以，底物的流加必须兼顾细胞生长和产物的合成。

3.4组合流加蔗糖和玉米浆结合溶氧控制对辅酶Q₁₀发酵的影响

微生物发酵法生产辅酶Q₁₀属典型的好氧发酵，供氧不足或过量均可能引起发酵产物的转换即代谢流迁移，从而影响目的产物的生物合成[7]。在分批发酵过程中，当细胞处于对数生长期时溶解氧浓度会由于菌体的快速生长而迅速降至最低点，而在发酵后期又会因碳源耗尽和细胞生长速度下降致使溶解氧上升。发酵过程中如果外界没有提供充足的氧，则因细胞密度增加使细胞氧摄取显著降低，而溶解氧缺乏又往往会引起细胞内物质代谢发生变化或增加副产物，最后影响到辅酶Q₁₀的发酵产量。当供氧量与需氧量协调，合理满足微生物不同生理阶段对氧的需求时，可使辅酶Q₁₀的生产能力达到最大。为控制发酵过程中最佳的溶解氧浓度，可根据发酵过程对溶解氧浓度和底物的需求，用DO-stat补料方式来控制辅酶Q₁₀的发酵过程[8]，在发酵前期可通过转速和通气量控制溶解氧在50%左右。从发酵第24 h开始，在减速流加蔗糖的同时以7.5 mL/(L·h)的速度流加玉米浆，可保持溶解氧的浓度在35%左右（图13）。采用蔗糖与玉米浆混合流加并结合溶解氧控制，辅酶Q₁₀的积累可达到最大为156.2 mg/L。

4结论

实验证明，合成辅酶Q₁₀，补料发酵生产明显优于分批发酵，并且补料方式、补加底物的量都影响着辅酶Q₁₀的合成量。当底物消耗速率较高，细胞生长较快时，辅酶Q₁₀的合成速率较低，在细胞生长的稳定期辅酶Q₁₀合成继续进行。细胞的生长与辅酶Q₁₀的合成属于半耦联型，底物的流加必须兼顾细胞生长和产物的合成。采用补料分批发酵方式不仅可减少底物的反馈抑制，而且可增大发酵过程中的溶氧，进一步提高辅酶Q₁₀的合成量。从发酵第24 h开始，在减速流加蔗糖的同时以7.5 mL/(L·h)的速度流加玉米浆，辅酶Q₁₀的积累可达到最大为156.2 mg/L，与不补料相比产量提高了58.1%。

参考文献

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[3]吴祖芳，堵国城，陈坚. 营养条件和流加发酵对放射根瘤菌（Rhizobium radiobacter）产辅酶Q₁₀的影响[J]. 生物工程学报，2003，19（2）：212-216.

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[5]张延静，袁其朋，梁浩. 产辅酶Q₁₀酵母的发酵条件研究[J].氨基酸和生物资源，2004，26（1）：55.

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[7]Kuniaki S, Hisao T, Susumu S, et al. Agitation-aeration studies on coenzyme Q₁₀ production using rhodopseudomonas spheroides [J]. Biotech Appl Biochem , 1992, 16(1):19-28.

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