酶解法提取葡萄酒泥中白藜芦醇工艺研究

材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器 葡萄酒泥由新疆乡都酒业有限公司提供，为泥状物，经3 000r/min离心，弃去上层清液，沉淀物自然晾干，粉碎之后过80目筛备用；纤维素酶由上海蓝季科技发展有限责任公司提供；白藜芦醇标准品由美国Sigma公司提供；无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等均为AR，由天津市天津市致远化学试剂有限公司提供。UV2000紫外可见分光光度计，日本岛津；756紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；PL303电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；RE-52旋转蒸发器，上海东玺制冷仪器设备有限公司；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 白藜芦醇测定方法[11] 准确称取白藜芦醇标准品0.1g，用甲醇溶解，并定容到10mL，摇匀，备用，得白藜芦醇对照品储备液。取白藜芦醇对照品储备液置于1cm比色皿中，以甲醇为参比，用紫外分光光度计在200～800nm波长间扫描，该标准溶液在306nm处有最强吸收峰。移取不同体积白藜芦醇对照品储备液置于10mL容量瓶中，配制成一系列不同浓度的标准溶液，于306nm处测定吸光度值，绘制标准曲线，以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归线方程y=0.5624x-0.0347（R2=0.994 2），线性范围为0.3～1.59μg/mL。式中：y为吸光度值，x为白藜芦醇质量浓度。

1.3 白藜芦醇提取方法 称取一定量葡萄酒泥粉末至锥形瓶中，加入适量水和纤维素酶在一定的温度、一定的pH值下酶解一定时间，酶解后加入150mL70%乙醇，于70℃恒温提取1h后抽滤，收集滤饼，得白藜芦醇粗品。然后将此粗品用甲醇溶解、定容，并稀释适当倍数后测定提取液的吸光度，由回归线性方程得出白藜芦醇提取量，公式如下：

提取量（μg·g-1）=提取液中白藜芦醇质量浓度×提取液体积/葡萄酒泥质量

经分析后确定酶解温度、酶用量和酶解时间是酶解法影响白藜芦醇提取量的主要因素，采用单因素实验和正交试验探讨白藜芦醇提取最佳实验条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶浓度对白藜芦醇提取率的影响 在酶解温度为40℃，缓冲液pH值4.0条件下，分别添加浓度为0.5mg/g、1.0mg/g、1.5mg/g、2.0mg/g、2.5mg/g、3.0mg/g的纤维素酶，酶解60min。不同酶浓度对白藜芦醇提取量的影响如图1所示。由图1可知，随着酶浓度的增加，白藜芦醇的提取量也增大，当酶浓度为1.5mg/g时，白藜芦醇的提取量达到最大，此后随着酶浓度的增加，白藜芦醇的提取量略有下降。这可能是由于原料与酶分子的结合数量是有限的，当酶浓度较低时，酶分子与底物充分结合，酶浓度若过高，则过量的酶分子不利于分子定向运动，酶活性反而降低[12]。

2.1.2 酶解温度对白藜芦醇提取率的影响 在缓冲液pH值4.0条件下，添加浓度为1.5mg/g的纤维素酶，分别在温度30～55℃酶解60min。不同酶解温度对白藜芦醇提取量的影响如图2所示。由图2可知，随着温度的增加，白藜芦醇的提取量也增大，当酶解温度达到45℃时，提取量达到最大，此后再随着酶解温度的增加，白藜芦醇的提取量呈下降趋势。在酶解反应中，温度不仅影响反应速度，而且影响酶的活性，温度升高，酶的活性降低，且白藜芦醇是热敏性物质，高温下易被氧化[13]。

2.1.3 酶解时间对对白藜芦醇提取率的影响 在酶解温度为45℃，缓冲液pH值4.0条件下，添加浓度为1.5mg/g的纤维素酶，分别酶解20～100min。酶与原料结合发生酶解反应需要一定的时间，由图3可知，随着酶解时间的延长，白藜芦醇提取量也随之增大，酶与原料充分结合后再延长时间，提取量变化不大。因此，确定酶解时间为60min。

2.1.4 pH值对对白藜芦醇提取率的影响 在酶解温度为45℃条件下，分别在pH值为2～7的溶液中添加浓度为1.5mg/g的纤维素酶，酶解60min。不同pH值对白藜芦醇提取量的影响如图4所示。大多数的酶的活性对环境pH的影响较大，pH的改变会破坏酶的结构，从而使酶的活性降低，影响酶解反应。由图4可知，白藜芦醇提取量在pH值为4.0时最大。

2.2 酶解法提取葡萄酒泥中白藜芦醇正交试验 根据单因素试验的研究结果，将酶浓度、酶解温度和酶解时间作为考察因素，采用L9（33）正交试验对白藜芦醇酶解工艺进行优化。试验因素与水平见表1，试验结果见表2。

由表3正交试验方差结果可知，在90%可信度时，因素A和C对白藜芦醇提取量影响显著。结合表2极差（R）分析可以看出，各因素对结果的影响主次顺序为：A>C>B，最佳工艺组合为A2B1C3，即酶浓度为1.5mg/g，酶解温度为40℃，酶解时间为75min。按此最佳条件进行提取，白藜芦醇提取量为80.2μg/g（n=3），RSD值为0.45%，此优化条件具有重复性、可靠性。

3 结论

本实验以乙醇为提取剂采用酶解法提取葡萄酒泥中的白藜芦醇，通过单因素试验和正交试验得出较佳的酶解工艺条件为pH4.0，酶浓度1.5mg/g，在40℃下酶解75min，白藜芦醇提取量为（80.2±0.33）μg/g。

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（责编：张宏民）

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