苦丁茶甲醇提取物对过氧化氢诱导巨噬细胞炎症的影响

材料與方法

1.1 材料与试剂

苦丁茶，老叶烘干后磨粉过筛，甲醇萃取后蒸馏分离，冷冻干燥处理，三蒸水配制的溶液经0.45 μm滤膜过滤后于-20 ℃保存；绿原酸，SIGMA公司提供；H2O2，广州化学试剂厂提供；NO，IL-6，TNF- α试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；MTT，DMSO，Biotopped公司提供；DMEM培养基、胰酶、小牛血清、抗生素，GIBCO公司提供。

1.2 仪器与设备

旋转蒸馏仪、电子天平、6/24/96孔细胞培养板、酶标仪、超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、高速冷冻离心机。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞培养

RAW264.7细胞培养基含10%胎牛血清和1% 抗生素的DMEM，并置于细胞培养箱（37 ℃，5% CO2）。细胞铺满培养皿底70%～80%时，进行传代到第3代，并开始细胞试验。

1.3.2 苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对巨噬细胞存活率的影响

利用不同质量浓度的苦丁茶甲醇提取物（0，200，400，800，1 000 μg/mL）和不同质量浓度的绿原酸（0，5，10，20，40 μg/mL）对RAW264.7细胞进行处理，并把MTT溶液添加到各个处理组，于波长570 nm处测其吸光度。

1.3.3 苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对过氧化氢诱导巨噬细胞的影响

利用不同质量浓度的苦丁茶甲醇提取物（0，200，400，800，1 000 μg/mL）和不同质量浓度的绿原酸（0，5，10，20，40 μg/mL）对RAW264.7细胞预处理12 h，然后用过氧化氢（H2O2，0.12%）诱导4 h，并收集细胞培养液，用试剂盒测定NO含量。

1.3.4 苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对过氧化氢诱导巨噬细胞IL-6和TNF-α的影响

利用不同质量浓度的苦丁茶甲醇提取物（0，200，400，800，1 000 μg/mL）和不同质量浓度的绿原酸（0，5，10，20，40 μg/mL）处理RAW264.7巨噬细胞12 h，然后用H2O2（0.12%）诱导4 h，收集细胞培养液，用试剂盒测定IL-6和TNF-α的水平。

1.4 统计分析

采用SPSS 10.0统计软件对试验数据进行统计学分析，并用GraphPad Prism5作图。p<0.05 为显著性差异，p<0.01为极显著差异。

2 结果与分析

2.1 苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对巨噬细胞存活率的影响

苦丁茶甲醇提取物对巨噬细胞存活率的影响见图1，绿原酸对巨噬细胞存活率的影响见图2。

由图1和图2可知，苦丁茶甲醇提取物（0～ 1 000 μg/mL）和绿原酸（0～40 μg/mL）在设定质量浓度范围内，不影响RAW264.7细胞的存活率，表明苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对细胞不产生毒性。

2.2 苦丁茶甲醇提取物和绿原酸对过氧化氢诱导巨噬细胞NO的影响

苦丁茶甲醇提取物对H2O2诱导RAW264.7细胞NO的影响见图3，绿原酸对H2O2诱导RAW264.7细胞NO的影响见图4。

由图3和图4可知，苦丁茶甲醇提取物和绿原酸显著降低H2O2诱导RAW264.7细胞的NO含量（p<0.01），表明苦丁茶甲醇提取物和绿原酸可减少细胞氧化应激。

2.3 苦丁茶甲醇提取物对过氧化氢诱导巨噬细胞IL-6和TNF-α的影响

苦丁茶甲醇提取物对H2O2诱导巨噬细胞IL-6的影响见图5，苦丁茶甲醇提取物对H2O2诱导巨噬细胞TNF-α的影响见图6。

由图5和图6可知，苦丁茶甲醇提取物和绿原酸显著增加H2O2诱导RAW264.7细胞的IL-6和TNF-α（p<0.01），表明苦丁茶甲醇提取物和绿原酸可促进细胞的凋亡。

3 讨论与结论

一氧化氮（NO）是具有生物活性的气体分子，是细胞间信息传递的重要调节因子，并介导细胞免疫和炎症的功能，NO的过量生成与炎症的产生具有密切关系。

结果表明，苦丁茶提甲醇取物和绿原酸对RAW 264.7细胞不产生毒性效应，且H2O2诱导的NO释放有抑制作用，呈明顯剂量依赖关系。但是，苦丁茶甲醇提取物升高了H2O2诱导RAW264.7细胞的TNF-α和IL-6的水平。卞梦瑶等人发现，生姜油树脂抑制H2O2诱导RAW264.7细胞的NO释放同时，通过显著降低TNF-α和IL-6的水平，降低细胞凋亡来保护细胞。这与试验结果差异较大。苦丁茶甲醇提取物对细胞不具有毒性，而且对NO释放有抑制作用，但在H2O2诱导下反而促进其凋亡[3]，这个过程可能较为复杂，需要进一步的研究。

综上所述，苦丁茶甲醇提取物富含绿原酸，通过抑制NO释放，从氧化应激中保护细胞，为苦丁茶的综合开发利用提供依据。

参考文献：

崔海燕，韩晨露，肖鹏，等. 过氧化氢刺激RAW264.7巨噬细胞促炎细胞因子和趋化因子基因表达[J]. 中国生物化学与分子生物学报，2015，30（7）：734-740.

胡宗福，于文利，赵亚平. 绿原酸清除活性氧和抗脂质过氧化的研究[J]. 食品科学，2006，27（2）：128-130.

李宜培. 线粒体损伤与细胞凋亡[J]. 河南职工医学院学报，2008，20（1）：94-97.

推荐访问： 过氧化氢 苦丁茶 甲醇 提取物 炎症

---