纳米材料应用于DNA检测领域的研究进展

摘 要 本文主要评述了近年来纳米材料在除了PCR领域以外的DNA检测方面的研究进展。对以纳米材料（纳米粒子、纳米纤维、纳米线、纳米管）为单元, 或以纳米器件的制备为实验方法而开展的DNA检测方面的工作进行了介绍。研究表明，基于纳米材料的DNA检测法，无论是在定位、可视化还是多重检测等方面都比传统PCR技术的检测方法表现出其自身的优越性。在以纳米材料为单元的研究中，基于纳米粒子标记的DNA检测方法研究的最多。本文分别进行了例证说明，具体内容包括：比色法、荧光检测法、共振光散射法、表面增强拉曼光谱法、电化学法、MALDI-TOF质谱分析法、元素分析法。而围绕纳米器件制备方法开展的DNA检测研究中，从4个方面进行了介绍：纳米排列图案法、纳米电机械设备法、纳米孔检测法和微排列检测法。

关键词 纳米材料；DNA检测；灵敏度；选择性；综述

1 引 言

DNA是遗传信息的承担者，是生物遗传的主要物质基础。由于对每一种生物体来说，核酸的序列都是独一无二的。因此，在诊断和识别各种疾病时，这些细菌、病毒、病原体的核酸序列就成为了研究对象。目前，很多疾病的序列信息已被人们掌握，为了能够有效抗击这些疾病，及早和准确地探测DNA序列显得尤为重要。许多研究小组对基于纳米技术的核酸的序列进行了研究，证明其可与传统的荧光耦合聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）′DNA检测方法相媲美[1～7]。PCR技术，可以将部分DNA序列进行复制，信号放大，在灵敏度方面代表了检测的极限[8]。而基于纳米材料的DNA检测手段则在定位、可视化、多重检测等方面更具有优势。因此，为了将针对核酸为基础的检测手段推广到一些实时的护理站，像医生的办公室、战场、第三世界、以及在生物恐怖袭击事件中第一反应现场等场所，促使人们去探索更加方便有效的检测DNA序列的方法。

纳米材料是指颗粒尺寸在1～100 nm范围内的超微粒子或其组装结构，由于其处于微观区域，具有许多与同质分子不同的物理化学性质，如不同尺寸和形状的纳米粒子表现出显著不同的光学性质及特殊的磁、电、热力学等性能。纳米材料还是优良的生物分子标记物。本文主要综述了纳米材料在除PCR技术以外的DNA测序方面研究较多的一些方法。

2 基于纳米粒子标记的DNA检测

2.1 比色法

Elghanian等[9]基于金纳米粒子溶液颜色变化对DNA进行了检测。在该研究中，用两种5′端带巯基的24个碱基的寡核苷酸通过AuS键分别在13 nm的金纳米粒子上进行组装，形成两种带不同序列寡聚核苷酸的金探针1和2。在24个碱基中，靠近金纳米粒子的前12个碱基充当柔性间隔基团，后12个碱基作为识别基团和目标DNA进行杂交配对（图1）。同时含有探针1和探针2的溶液呈现红色。由于一个纳米金上有多个DNA探针，当加入目标DNA后，在熔链温度以下，探针1、2与目标DNA以头-尾排列方式（图1A）或尾-尾排列方式（图1B）杂交形成网状的纳米金聚集物。由此导致金纳米粒子相互靠近，使其质谱共振带移动，相应的溶液颜色由原来的红色变为紫色。这种通过颜色变化来检测目标DNA是一种既快速又简单廉价的好方法，不需要昂贵的检测仪器，目标DNA的检出限可达10 nmol/L。

图1 金纳米粒子探针1和探针2以头-尾排列方式（A）或尾-尾排列方式（B）和目标DNA杂交[9]

Fig.1 Head-to-tail （A） and tail-to-tail （B） alignments of gold nanoparticle probes[9]

Thompson等[3]以同样的方法，利用寡核苷酸修饰的银纳米粒子作为探针，通过杂交熔链的颜色变化实现对目标DNA的检测，实验分别实现了两种银探针以头-头、头-尾以及尾-尾的排列方式和目标DNA进行杂交，检出限比用金纳米粒子的进行的检测实验低50倍[3]。

Hong等[4]建立了多功能纳米粒子界面组装方法。利用金纳米粒子探针（DNA-AuNPs）和氟分子标记的探针（F-DNA）两种类型探针进行表征。这种方法结合了自然界本来赋予的DNA杂交组装，并专门设计的利用氟相互作用的聚集策略，进行了DNA检测。反应体系中加入目标DNA后，在气相-液相界面、液相-液相界面、液相-固相界面观察到紫色的金膜或蓝色的金纳米粒子的密堆积结构（图2）[4]。

分 析 化 学第39卷

第1期洪 敏等： 纳米材料应用于DNA检测领域的研究进展

2.2 荧光检测法 图2 基于金纳米粒子气-液（b）、气-固（c）界面组装的DNA检测示意图[4]

Fig.2 Schematic representation of DNA detection strategy by gas-liquid （b） and solid-liquid （c） interfacial gold nanoparticle assembly[4]

早在1970年，Drexhage等[10]发现在金属膜附近荧光团的发射寿命依赖于它距金属表面的距离。后被证实当荧光团紧紧靠近金属粒子时，荧光被猝灭；而当荧光团距金属粒子一定距离时，荧光被增强。这种被金属粒子增强的荧光称为金属增强荧光（MEF），用于生物检测中可以增强目标分子探测的灵敏度。利用这种效应发展了一种基因检测的重要方法——分子信标（Molecular beacon），其基本原理是通过设计DNA茎环结构来构建荧光分子-猝灭剂对，茎环结构在检测到靶基因时会发出很亮的指示荧光。分子信标常用于核酸检测，但它的缺点是分子猝灭剂的猝灭效率不高, 以金纳米粒子代替分子猝灭剂的猝灭效率极大提高，用作探针检测DNA的灵敏度也会提高。

图3 荧光猝灭检测DNA示意图[10]

Fig.3 Nanoparticle-based probes and their operating principles[10]

Maxwell等[11]用2.5 nm的金纳米粒子作为支架和猝灭剂。金纳米粒子一侧连接带巯基官能团, 另一侧是带荧光团的核苷酸链。硫醇吸附在金核的表面，荧光团靠非特异性吸附作用也吸附在金核表面，导致在金核外组装的DNA链形成拱形结构（图3）。此时，金纳米粒子猝灭荧光团的发射。目标DNA加入后与金核上拱起的识别DNA杂交，原有的拱形构象快速发生变化，被拉成直链。荧光团远离金核约10 nm，被猝灭的荧光团发出荧光，实现对目标DNA的检测。

Song等[12]构建了多色纳米信标（Multicolor nanobeacon），并应用该探针实现多种肿瘤基因标志物的同步检测，而且能够检测低至pmol/L的DNA, 并可以很好地区分单碱基错配。此外，石墨烯作为一种片层纳米材料，其纳米界面能量转移特性（Nanoscale surface energy transfer, NSET）对荧光染料也具有很高的猝灭效率。研究表明，氧化石墨烯与单双链DNA之间的相互作用差别显著，荧光染料标记的单链DNA能够吸附在石墨烯表面，导致荧光猝灭；而双链DNA与石墨烯之间的作用则很弱。在此基础上，He等[13]发展了基于氧化石墨烯的多色荧光探针，用于多种基因的同时快速灵敏检测。 图4 基于QD/Cy3标记的DNA的荧光共振能量转移的DNA杂化检测示意图[2]

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