扶正化瘀胶囊对心肌梗死大鼠Rock1、Rock2表达的影响

摘要：目的 观察扶正化瘀胶囊对心肌梗死大鼠RhoA/Rock信号转导通路主要成员Rock1、Rock2表达的影响，探讨其改善心室重构心肌纤维化的可能机制。方法 采用冠状动脉左前降支结扎术制备急性心肌梗死模型，成模大鼠随机分为模型组、扶正化瘀胶囊组和盐酸法舒地尔组，另设假手术组只穿线不结扎作为对照，每组8只。造模后第2日开始给予相应药物干预，连续4周。免疫组化检测心肌组织Rock1、Rock2蛋白表达，实时荧光定量PCR检测Rock1、Rock2 mRNA表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Rock1、Rock2蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，盐酸法舒地尔组和扶正化瘀胶囊组大鼠心肌组织Rock1、Rock2蛋白表达明显降低（P<0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Rock1 mRNA表达明显升高 （P<0.05）；与模型组比较，盐酸法舒地尔组大鼠心肌组织Rock1 mRNA表达明显降低（P<0.05），盐酸法舒地尔组和扶正化瘀方组大鼠心肌组织Rock2 mRNA表达明显降低（P<0.05）。结论 扶正化瘀胶囊通过降低心肌梗死大鼠梗死边缘区心肌组织Rock1、Rock2的表达，发挥其抗心室重构心肌纤维化的作用。

关键词：心肌梗死；心肌纤维化；Rock；扶正化瘀胶囊；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.018

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）09-0074-04

Effects of Fuzheng Huayu Capsule on Expressions of Rock1 and Rock2 in Rats with Myocardial Infarction ZHANG Dong-mei， WU Ai-ming， LOU Li-xia， ZHAO Ming-jing， LV Xi-ying， ZHAO Yi-zhou， CHAI Li-min， GAO Yong-hong， SUN Yi-kun， ZHAO Jiu-li （Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Fuzheng Huayu Capsule on the expressions of the main roles， Rock1 and Rock2， in RhoA/Rock signal transduction pathway in rats with myocardial infarction （MI）； To explore the possible mechanism of Fuzheng Huayu Capsule to improve ventricular remodeling in myocardial fibrosis. Methods The MI model was induced by ligation of the left coronary artery. Rats with MI were randomly divided into the model group， Fuzheng Huayu group and Fasudil hydrochloride group. A sham-operation group threading without ligation was setting as a control group， with eight rats in each group. The rats were treated with corresponding medicine for 4 weeks from the second day after modeling. The expression of Rock1， Rock2 and its mRNA were detected by immunohistochemical and real-time PCR method. Results The protein expression of Rock1 and Rock2 in model group were significantly higher than those in the sham-operation group （P<0.05）. The protein expression of Rock1 and Rock2 in the Fuzheng Huayu group and Fasudil hydrochloride group were lower than those in the model group. The mRNA expression of Rock2 was significantly higher in the model group than that in the sham-operation group （P<0.05）. The mRNA expression of Rock1 in the Fasudil hydrochloride group was lower than that in the model group （P<0.05）. The mRNA expression of Rock2 in the Fuzheng Huayu group and Fasudil hydrochloride group was lower than that in the model group （P<0.05）. Conclusion Fuzheng Huayu Capsule can decrease the expression of Rock1， Rock2 and Rock2 in the marginal zone of myocardial infarction in rats with MI. The anti ventricular remodeling mechanism of Fuzheng Huayu Capsule maybe related with this.

Key words： myocardial infarction； myocardial fibrosis； Rock； Fuzheng Huayu Capsule； rats

心肌纤维化是多种心血管疾病发生发展的共同病理基础，是造成心律失常、心衰的微观病理机制[1]。近年来研究发现，RhoA/Rock信号转导通路参与了心肌纤维化的发生[2]。扶正化瘀胶囊临床用于抗肝纤维化，前期研究显示，其具有改善心肌梗死大鼠左室重构、提高心功能、防治心肌梗死后心肌纤维化的作用[3-4]，但具体作用机制仍未阐明。因此，本实验采用冠状动脉左前降支结扎术制备急性心肌梗死大鼠模型，观察扶正化瘀胶囊对RhoA/Rock信号转导通路主要成员Rock1、Rock2表达的影响，探讨其改善心室重构心肌纤维化的可能机制。

1 实验材料

1.1 动物

健康雄性SD大鼠40只，6周龄，体质量200～220 g，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0007。饲养于北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部和北京市重点实验室动物房，SPF级常规饲养。

1.2 药物

扶正化瘀胶囊，每粒0.5 g，上海黄浦制药有限责任公司，批号110611，以生理盐水配制成0.08 g/mL药液；盐酸法舒地尔注射液，30 mg/2 mL，天津红日药业股份有限公司，批号1108241。

1.3 主要试剂与仪器

Rabbit anti-Rock1、Rock2抗体，武汉博士德生物工程有限公司；二步法免疫组化检测试剂盒PV-6001，北京中杉金桥生物有限公司；RT试剂盒，Promega公司；SYBER Green，ABI公司，引物由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。RSP-1002型呼吸机（Kent Scientific Corporation），XJ-11型心电示波仪（上海医学电子仪器厂），JA1003N型千分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司），SPOTⅡ数码成像系统（Diagnostic Instruments公司），Meta Morph图像分析系统（Vniversal Imaging公司），Gene Quant（Pharmacia Biotech），GeneAmp PCR system 9700（Applied Biosystems公司），Mx3000P实时荧光定量PCR仪（stratagene）。

2 实验方法

2.1 造模

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，背位固定，气管插管，连接呼吸机，80次/min、潮气量0.7～0.8 mL行人工呼吸。左胸前区备皮去毛，消毒，于左侧第3、4肋处横向切开皮肤，长约1.5 cm，钝性分离肌层，沿第3、4肋间隙打开胸腔，以开胸器扩大手术视野，撕开心包，在动脉圆锥与左心耳间下约2 mm处用5/0线结扎左冠状动脉，当心电图导联显示ST段显著抬高后，重置心脏于胸腔，并立即分层缝合胸壁。术后3 d腹腔注射青霉素80万U/d预防感染。假手术组手术过程同上，但只穿线不结扎左冠状动脉。造模组和假手术组大鼠术后常规饲养。

2.2 分组与给药

剔除心电图无心肌梗死表现的模型大鼠，随机分为模型组、扶正化瘀胶囊组、盐酸法舒地尔组，另设假手术组做对照，每组8只。造模后第2日灌胃给药，每日1次。给药剂量根据等效体表面积公式计算，扶正化瘀胶囊组按0.5 mL/100 g剂量灌胃给药（相当于扶正化瘀胶囊0.4 g/kg体质量），盐酸法舒地尔组按0.07 mL/100 g剂量腹腔注射，模型组和假手术组给予等量生理盐水灌胃。每7 d称重调整药量1次，连续4周。

2.3 免疫组化检测心肌组织Rock1、Rock2蛋白表达

心肌组织切片脱蜡至水，3%H2O2灭活内源性过氧化酶，枸橼酸缓冲液热修复，自然冷却后0.01 mol/L PBS冲洗，相应的一抗1∶100稀释后，4 ℃孵育过夜，0.01 mol/L PBS冲洗，滴加PV-9001山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS冲洗，DAB室温孵育5 min，镜下观察显色情况，自来水终止反应。梯度乙醇和二甲苯脱水透明，中性树脂封片。染色后心肌组织切片，采用图像分析软件采集数据，每组4张切片，每张切片随机选择5个视野，计算阳性区域所占总面积。

2.4 RT-qPCR检测心肌组织Rock1、Rock2 mRNA表达

取约50 mg梗死边缘新鲜心肌组织，加1 mL Trizol，冰上匀浆，提取组织总RNA。经紫外分光光度计A260及A280定量，计算RNA浓度及纯度。采用二步法检测Rock1、Rock2的mRNA表达。严格按照试剂盒说明书进行操作。取2 μg总RNA进行反转录，得cDNA链。以cDNA为模板进行RT-qPCR反应，反应体系为25 μL，含1 μL cDNA，10 μmol/L上下游引物各1 μL，2×SYBER Green PCR mix 12.5 μL，不足体积以无RNA酶的水补齐。以β-actin作为内参照。引物序列：Rock1 sense 5"-AGGGACATCATGGCATTT GC-3"，antisense 5"-CCACTTTTCAGGCACTCGT-3"，产物长度150 bp；Rock2 sense 5"-CTTCCCAACCA ACTGTGAGG-3"，antisense 5"-AAATTTGCAGGGGGC TATG-3"，产物长度146 bp；β-actin sense 5"-TGTGAT GGACTCCGGAGACGG-3"，antisense 5"-ACAGCTTC TCTTTGATGTCACGC-3"，产物长度197 bp。PCR条件：95 ℃、10 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共35个循环。所得Ct值采用均一化处理，按2-ΔΔCt法进行计算。

3 统计学方法

采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。对所获数据进行正态分布和方差齐性检验，方差齐采用LSD，方差不齐采用Dunnetts"s C。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 扶正化瘀胶囊对模型大鼠心肌组织Rock1、Rock2蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Rock1、Rock2蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，盐酸法舒地尔组和扶正化瘀胶囊组大鼠心肌组织Rock1、Rock2蛋白表达明显降低（P<0.05）。结果见表1、图1、图2。

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Rock1 mRNA表达略升高（P>0.05），Rock2 mRNA表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，盐酸法舒地尔组Rock1 mRNA表达明显降低（P<0.05），盐酸法舒地尔组和扶正化瘀方组心肌组织Rock2 mRNA表达明显降低（P<0.05）。结果见表2。

5 讨论

扶正化瘀胶囊主要由丹参、桃仁、松花粉、五味子、绞股蓝、虫草菌丝等药物组成，具有活血化瘀、益气扶正的功效，研究表明，其具有较理想的抗肝纤维化的作用[5]。

多脏器纤维化（肝、肾、肺、心等）虽然是相对独立的疾病，但都有着相同的病理改变及正虚血瘀的共同发病规律，即器官纤维化因子分泌增加、细胞外基质合成增多与降解减少、纤维结缔组织增生，通过扶正化瘀可达到异病同治的效果。正虚血瘀病机同样体现在心室重构心肌纤维化的过程中。我们的前期研究表明，采用冠脉左前降支结扎致心肌梗死后心力衰竭模型大鼠血瘀证贯穿于病变整个过程，心气虚证随着病变的发展而出现并加重，呈现气虚血瘀证候表现及左室重构和功能损伤的病理表现[6]。扶正化瘀胶囊不仅可缩小模型大鼠心肌梗死范围区面积和梗死百分比，提高心功能，还具有抑制心肌胶原表达、改善左室重构的作用，在一定程度上防治心肌梗死后心肌纤维化[3-4]。

Rock又称Rho激酶，是小GTP结合蛋白RhoA重要效应分子[7]，包括Rock1和Rock2两个亚型，是Rho/Rock信号通路的关键信号分子。有研究显示，RhoA/Rock信号转导通路在心肌梗死后心肌纤维化及心室重构中起关键的调节作用[8]，它参与细胞外基质的调控，在转化生长因子（TGF）β引发的胶原合成中扮演着中继子的角色。Rock1可调节心肌素相关转录因子介导的肌纤维母细胞激活，促进血清应答因子活化和胶原沉积[9]。主动脉缩窄Rock1基因敲除大鼠术后第3周血管周围和间质纤维化减轻，且心肌细胞释放TGF-β2和结缔组织生长因子等细胞因子减少。RhoA还可以通过与Rho激酶结合刺激基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-9表达，引起细胞外基质结构改变，促进心室重塑和心功能恶化[10]。应用Rock抑制剂可减弱Ⅰ型胶原启动子的活性[11]，延缓或抑制心室重构，改善预后[12]。

本研究结果显示，模型组大鼠心肌组织Rock1、Rock2蛋白表达及Rock2 mRNA表达均较假手术组明显上调，进一步证实Rock参与了心肌梗死后心室重构心肌纤维化的发生。而扶正化瘀胶囊可降低心肌梗死边缘区收肌组织Rock1、Rock2的蛋白表达，下调Rock2的mRNA表达，提示该方对Rock具有调节作用，其抑制心肌间质胶原合成、减轻心肌纤维化的作用可能与此有关。方中丹参的主要成分丹参酮ⅡA亦能下调RhoA、Rock1的蛋白表达，使TGF-β1和结缔组织生长因子水平下降[13-14]。盐酸法舒地尔作为特异性Rho激酶抑制剂，能降低Rock1、Rock2及其mRNA的表达，具有抗心肌纤维化的作用，其机制可能与阻断Rho/Rock信号通路、降低炎性因子表达[15]、部分抑制肌成纤维细胞表型分化[16]、下调Ⅰ型和Ⅲ型胶原基因表达有关[17]。

综上所述，扶正化瘀胶囊可降低心肌梗死大鼠梗死边缘区心肌组织Rock1、Rock2的蛋白表达及Rock2的mRNA表达，其抑制心肌纤维化、改善心肌梗死后左室重构的作用可能与此有关。扶正化瘀胶囊是否具有通过Rho/Rock信号通路调控心肌梗死后心室重构心肌纤维化的作用机制，值得进一步研究。

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