消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2、环氧合酶2表达及细胞生物学行为的影响

材料

1.1 细胞株

人结肠癌SW480细胞，中国科学院上海细胞库。

1.2 药物及制备

消痰通腑方由制半夏、制南星、大黄、陈皮、鸡内金、炙甘草组成，所有饮片由上海雷允上药业有限公司提供。消痰通腑方由第二军医大学试剂中心制备，按比例（制半夏15 g，制南星15 g，大黄6 g，陈皮15 g，鸡内金15 g，炙甘草6 g）称取10倍量的饮片，加8倍体积的75%乙醇，回流提取煎煮2次，每次1 h，将煎液合并后离心、浓缩、干燥至干品即得消痰通腑方醇提物，其得率为1 g原药材/0.26 g。等比例换算至药物浓度分别为2.24、8.96 g/mL。实验前称取适量醇提物干粉，经涡旋、超声、水浴等方法使其充分溶解于DMEM培养基后，0.22 μm滤器过滤并配置成所需浓度的溶液，4 ℃冰箱贮存备用。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM培养基，胎牛血清（FBS），0.25%胰蛋白酶、青链霉素混合液，qPCR、cDNA反转录、总RNA提取试剂盒，transwell小室，CCK8溶液，PLA2抗体，COX-2抗体，PLA2 shRNA质粒，shRNA对照质粒，shRNA质粒转染试剂，均购自Santa cruz公司。

超净工作台（广州深华生物技术有限公司），CO2培养箱、BIOMATE型紫外可见分光光度计（Thermo），LXJ-ⅡA型离心机（上海安亭科学仪器厂），GE4852 型PCR仪（杭州柏恒科技有限公司），DYCZ-24DN电泳仪（北京六一仪器厂），Tocan500全自动凝胶成像系统（南京裴尔森生物科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养及药物干预

结肠癌SW480细胞常规培养于含10%FBS和1%青-链霉素双抗DMEM培养基，每隔1～2 d换液，待细胞融合约80%时进行细胞传代及种板。消痰通腑方原药材浓度为8.96 g/mL，经0.22 μm无菌过滤器过滤，用培养基稀释成实验所需浓度。实验根据药物浓度分为对照组（0 g/mL）、低剂量组（2.24 g/mL）、高剂量组（8.96 g/mL）。

2.2 CCK-8法检测

取对数生长期上述3组细胞，经胰酶消化后，接种于96孔板，每孔细胞数为1×103。每组设5个复孔。分别于24、48、72、96、120 h后加10 μL CCK-8溶液。置于培养箱培养4 h，于酶标仪波长450 nm处测定细胞吸光度（A）值，计算细胞相对增殖率[（实验组A值-对照组A值）÷对照组A值×100%]。

2.3 平板克隆形成实验

取对数生长SW480细胞悬液梯度倍比稀释后，接种于6孔板中，每孔50个细胞。置于培养箱内培养24 h，各组分别加入各浓度消痰通腑方溶液，重新置于培养箱中，经常观察，当出现肉眼可见克隆时，弃去上清液，PBS清洗2次，甲醇溶液固定15 min后加Gimesa染液染色。计算克隆细胞数目。实验重复3次，取其平均值。

2.4 Transwell小室实验

收集3组细胞，800 r/min离心5 min，PBS清洗2次，用培养基重悬并调整细胞浓度为1×109/L。分别取100 μL细胞液置于Transwell小室上层，同时在下层加500 μL DMEM培养基。37 ℃培养箱中培养48 h，擦净小室滤膜上层的细胞。4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗并用结晶紫染色。每组同时做3个重复小室，200倍显微镜下计数并拍照。

2.5 RT-qPCR检测结肠癌SW480细胞磷脂酶A2和环氧合酶2 mRNA表达

从Gene Bank网站获取PLA2、COX-2基因序列，并使用Premier5.0软件设计引物（见表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用Trizol试剂提取细胞总RNA，每份样品均取2 μg，按试剂盒说明进行反转录。以Tubulin为内参，PLA2、COX-2表达的相对定量值用于统计分析。

2.6 Western blot检测结肠癌SW480细胞磷脂酶A2和环氧合酶2蛋白表达

用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解并收集细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度后加入上样缓冲液，煮沸变性。样品进行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h后，特异性一抗4 ℃摇床过夜，洗膜后，二抗孵2 h，EC显影。

2.7 shRNA转染实验

人结肠癌SW480细胞分为PLA2 shRNA干扰组、质粒对照组、对照组，每组设3个复孔。以2 μg PLA2 shRNA质粒和对照质粒分别转染SW480细胞，转染24 h后，用5 μg/μL嘌呤霉素筛选细胞株，继续培养24 h。对照组为不加任何处理的SW480细胞。

3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 消痰通腑方对结肠癌SW480细胞增殖的影响

高剂量组较对照组增殖能力明显减弱（P<0.05），低剂量组也能抑制细胞增殖但效果不如高剂量组，结果见图1。高剂量组克隆形成率为（48.38±3.67）%、低剂量组为（121.13±2.64）%，较对照组（205.65±3.72）%明显降低（P<0.05，P<0.01），结果见图2。

4.2 消痰通腑方对结肠癌SW480细胞侵袭能力的影响

消痰通腑方作用48 h，低、高剂量组较对照组穿膜细胞数明显降低（P<0.05，P<0.01）。结果见图3。

4.3 消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2和环氧合酶2 mRNA和蛋白表达的影响

消痰通腑方作用72 h，PLA2、COX-2 mRNA和蛋白表达量均显著降低，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；高剂量组较低剂量组差异更显著（P<0.05）。结果图4、图5。

4.4 PLA2 shRNA干扰后消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2和环氧合酶2蛋白表达的影响

PLA2 shRNA干扰48 h，与质粒对照组和对照组相比较，转染PLA2 shRNA质粒的SW480细胞PLA2蛋白表达明显受到抑制，PLA2 shRNA干扰成功。同时，COX-2的表达与PLA2的表达具有一致性。结果见图6。

5 讨论

中医学认为，结肠癌多因饮食失节，嗜食肥甘厚腻，困遏脾土，而致脾胃受损，脾运化失常，湿浊内生，气机阻滞，精微不能正常布散而发病。湿聚为痰，热炼津为痰，故湿热壅聚则久能生痰，搏结肠腑，致肠腑湿热重滞，气机运化不畅，大肠传导失司，痰热湿浊不能及时排除体外而在体内停聚，日久形成积块而成痰结[4]。

消痰通腑方为魏品康教授从痰论治消化道肿瘤的经验用方。研究表明，该方可抑制炎症因子引发的炎症反应[5-6]。方中制半夏、制南星为消痰散结之君药，大黄、炒枳实壳清热通腑为臣药，鸡内金、陈皮理气消积，顾护脾胃为佐使，炙甘草调和药性，共奏消痰散结祛除痰结、清热通腑推陈出新。PLA2是磷脂代谢的关键酶之一，可分解磷脂产生AA从而进一步产生COX-2、前列腺素E2（PGE2）等炎性介质，从而引发炎症。研究表明，PLA2的活化与多种肿瘤相关[7-9]。慢性炎症促进肿瘤的发生发展涉及多条细胞内信号通路，其中PLA2-COX-2-PGE2信号通路是其重要途径之一。研究表明，结直肠癌的发展常伴随着COX-2基因过度表达，其过度表达可通过促进细胞的增殖、存活，进而在肿瘤进展中发挥重要作用[10]。

本实验结果显示，与对照组比较，高剂量组能降低结肠癌细胞增殖能力（P<0.05），抑制结肠癌细胞的迁移（P<0.01）。低剂量组虽不如高剂量组效果好，但与对照组比差异有统计学意义（P<0.05）。而且消痰通腑方能降低结肠癌SW480细胞PLA2及COX-2的表达，PLA2 shRNA干扰实验进一步证实PLA2与COX-2的表达存在一致性，提示消痰通腑方可能通过降低PLA2的表达从而下调AA通路下游靶基因COX-2来调控结肠癌的增殖与迁移。

综上所述，本研究表明消痰通腑方可以抑制人结肠癌细胞SW480的增殖和迁移。其机制可能与抑制PLA2及AA通路中COX-2的表达有关，为消痰通腑方用于结肠癌的治疗提供了实验依据，但其体内的具体作用机制仍需进一步研究。

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