一氧化氮对采后芒果果实抗氧化酶活性的影响

材料与方法

1.1材料

本研究田间试验在广西壮族自治区百色某一果园进行，供试芒果（Mangifera indica L.），品种为Zill，从果园选择8年树龄的芒果树作为试材。花后130 d，选取大小相近、无病虫害、无机械损伤的果实200个，分别采用蒸馏水（对照）和100 μmol/L硝普钠（SNP，一氧化氮供体）浸泡30 min，然后室温下晾30 min后装入不封口的聚乙烯塑料袋（厚度为0.04 mm）中，每袋5个，20袋1组，置培养箱[（25±1）℃，90%～95%RH]中贮藏11 d。

1.2方法

1.2.1芒果果实硬度的测定 采用手持果实硬度计（FT-327UC果实硬度测试仪，Milano，意大利）测定芒果果实硬度，探头直径8mm，果实去皮后，每果实测其肩部3个点，平均值为该果的硬度（kg/m²）。

1.2.2芒果果實酶提取物的制备

每个处理随机选10个果实，取其果肉共10g，加入预冷的25 mL（含0.5 g聚乙烯吡咯烷酮）提取缓冲液，匀浆，其中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）提取缓冲液为50 mmol/L磷酸钠，pH7.8；过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）提取缓冲液为100 mmol/L磷酸钠，pH6.4；收集上清液用于酶活性分析。酶提取过程均在0～4℃下操作。

1.2.3测定指标与方法

可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250法，SOD活性测定采用氮蓝四唑法，以抑制氮蓝四唑光化还原50%为1个酶活力单位（U），其活性以U/mg蛋白质表示；CAT活性测定采用H²O²法，测定240mm处OD值的变化，以OD₂₄₀每分钟减少0.1为1个酶活力单位（U），其活性以U/mg蛋白质表示；POD活性测定采用愈创木酚法，测定470nm处OD值的变化，以OD₄₇₀每分钟增加0.01为1个酶活力单位（U），其活性以U/mg蛋白质表示；PPO活性测定参照Tian等的方法；丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法，以μmol/gFW表示MDA含量；过氧化氢（H₂O₂）含量测定采用二甲酚橙法，以μmol/gFW表示H₂O₂含量。

1.3数据处理

试验数据用Excel软件采用最小显著差数法（LSD）进行方差分析，检验差异显著性，实验重复3次。

2结果与分析

2.1 NO对芒果果实硬度的影响

果实硬度是评价果实成熟度的一个重要参数，图1所示，对照和处理果实的硬度在贮藏前3天无明显变化，此后，对照果实的硬度呈现下降趋势，但处理果实的硬度下降速率低于对照果实。贮藏至7d，处理果实的硬度显著高于对照果实，这种趋势一直保持到贮藏期结束。

2.2 NO对芒果果实中SOD、CAT、POD和PPO活性的影响

SOD主要功能是将超氧阴离子催化为较稳定的H₂O₂，以维护细胞活性氧代谢的平衡。如图2所示，随着贮藏时间的延长，处理和对照果肉中SOD活性均呈下降趋势，但是，处理果实SOD活性下降速率明显慢于对照果实，暗示NO抑制了SOD活性下降，从而保持了较高的超氧自由基清除能力。

CAT和POD主要生理功能是清除组织内多余的H₂O₂。尽管贮藏期间处理和对照果实中CAT和POD活性分别呈下降和上升趋势，但是，处理果实中CAT和POD活性高于对照果实，表明处理果实中保持较好地H₂O₂清除能力（图2）。

PPO是引起高等植物组织发生褐变主要酶类，图2所示，虽然贮藏期间处理和对照果实中PPO活性具有较大波动，但是它们中PPO活性均呈下降趋势，而且，处理果实PPO活性显著低于对照果实。

2.3 NO对芒果果实中H₂O₂和MDA含量的影响

H₂O₂作为活性氧（ROS）中的一名重要成员，可以通过损伤细胞核、氧化蛋白质和膜脂等途径影响细胞功能。图3所示，贮藏至第3天，对照果实中H₂O₂含量开始呈上升趋势，而处理果中H₂O₂含量却呈下降趋势。尽管贮藏期间H₂O₂含量呈现波动，但处理果实中H₂O₂含量显著低于对照果实，暗示SNP处理减少了果实中H₂O₂累积。

植物组织器官衰老时，往往发生膜脂过氧化作用，MDA是其产物之一。图3显示，贮藏前期（1～5d），对照和处理果实中MDA含量均呈上升趋势，它们之间差异不显著。贮藏至第7天，处理果实中MDA含量显著低于对照果实，说明NO减缓了芒果果实贮藏中、后期膜脂过氧化过程。

2.4处理果实生理生化指标之间的相关性分析

对SNP处理芒果果实抗氧化酶活性、过氧化氢、丙二醛和硬度等生理生化指标测定结果的相关性分析和显著性检验表明，CAT活性与SOD、PPO活性呈显著性正相关；另外，H₂O₂含量与SOD活性以及果实硬度与SOD、CAT、PPO活性呈正相关，MDA含量与SOD、CAT、PPO活性呈负相关以及果实硬度与SOD、CAT、PPO活性呈正相关，但相关性均不显著（表1）。

3讨论

ROS包括超氧阴离子（O₂-）、H₂O₂和羟基自由基（·OH）等是植物体代谢副产物，如果组织内ROS大量积累，将会造成细胞膜过氧化产物MDA大量积累，从而引发或加剧细胞膜脂质或膜脂过氧化作用，造成膜系统损伤。通常情况下，植物体内ROS的产生和清除受到抗氧化系统的精密调控。植物体一般存在酶促和非酶促两大类ROS清除系统。SOD、CAT和POD等属于酶促类抗氧化物质。SOD催化超氧阴离子为较稳定的H₂O₂，CAT催化H₂O₂發生歧化反应生成水（H₂O）和氧分子，CAT则催化由H₂O₂参与的各种还原剂的氧化反应：RH₂+H₂O₂→2H₂O+R。抗坏血酸、酚类化合物、生物碱等属于非酶促类抗氧化物质。植物体内保持较高的ROS清除酶活性和非酶抗氧化物质的含量，能更好地清除细胞自由基和ROS，减少ROS的积累，减少对细胞膜的伤害，可以达到延缓果实衰老的目的。采后水果和蔬菜ROS清除能力随着果蔬成熟度上升而下降，当ROS水平超过果蔬组织对其清除能力时，就会发生氧化胁迫，从而降低其贮藏品质和适销性。

本实验主要探讨NO对采后芒果果实中ROS清除系统的影响。结果表明，贮藏期间，SNP处理保持了果实中SOD、CAT和POD活性（图2），相关性分析也表明，CAT活性与SOD活性呈显著性正相关，而这两种酶活性的保持，有利于降低体内ROS，推测NO能通过保持CAT与SOD活性，从而有效地减轻芒果贮藏过程中组织过剩ROS对果实的损害。MDA作为膜脂过氧化的重要产物，是植物衰老的指标之一。MDA能强烈地与细胞内各种成分发生反应，引起酶和膜的严重损伤，降低膜电阻和膜的流动性，最终导致膜的结构及生理完整性的破坏。SNP处理降低了芒果果实中MDA积累（图3），相关性分析发现，MDA含量与SOD和CAT活性呈负相关，虽然其相关性不显著，暗示NO可以较好地保持SOD和CAT活性，有利于减少MDA对细胞膜的伤害，这与丹阳等对芥兰的研究结果一致。PPO是引起果实酶促褐变的主要酶类，它催化多酚氧化生成黑色素，影响果实外观。SNP处理芒果果实PPO活性较低，减缓了芒果褐变的速度，延长了贮藏时间，这与王欣等对双孢蘑菇的报道结果一致。综上所述，SNP处理提高了组织SOD、CAT和POD活性，降低了H₂O₂含量，进而降低了MDA对细胞膜的伤害，此外，SNP处理还很好地抑制PPO活性上升，延缓了果实硬度下降，从而延长了贮藏时间。因此，NO能有效减轻采后芒果果实氧化胁迫，从而延缓果实的成熟软化。

责任编辑：沈德发

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