利用废纸产纤维素酶复合菌系的筛选及性质研究

摘要：为了获得1组能够高效分解废纸并产胞外纤维素酶的复合菌系，采用外淘汰法，在常温条件下以土壤及枯枝落叶为菌源，以废打印纸为唯一碳源，筛选得到1组复合菌系PSD。结果表明，该复合菌系能够在6 d内分解纸总质量的71%，其中纤维素降解率为72%，半纤维素降解率为48%。此外，羧甲基纤维素酶活性在分解3 d时达到最高值 3.26 U/mL，半纤维素酶活性在分解4 d时达到最高值6.37 U/mL。当培养温度在25～35 ℃，培养基pH值在 6.0～8.0，培养基为Hutchinson时，复合菌系具有较好的纸分解效果和产酶活性。利用16S及26S rRNA克隆技术分析微生物组成结果表明，该复合菌系由细菌和真菌组成，其中细菌主要包括厚壁菌门、变形菌门及拟杆菌门，真菌主要包括波氏假性霉样菌（Pseudallescheria boydii）。由研究结果可知，得到的复合菌系PSD能够有效分解废纸并同时分泌纤维素酶，对打印纸废弃物的分解及资源利用具有一定的应用意义。

关键词：复合菌系;废纸分解;纤维素酶;微生物组成

中图分类号： S182;X705 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0237-05

随着现代制造技术的发展，一次性纸张已经成为廉价商品，过去40年内，全球紙的消费量增长了400%，每年产生的废纸量达4亿t以上。废纸作为最普遍的回收材料之一，理论上可循环使用6～7次，但是纸经多次回用后纤维流失率大，且纤维短，利用效率低，因此，全球纸张的平均回收水平只有2.4次[1]。不合理处理无法循环利用的废纸（如填埋或焚烧），会造成温室气体的排放、垃圾渗滤液污染等环境问题[2]。因此，开发多种资源化利用方式，对废纸进行充分利用，不仅可以节约大量植物木质纤维原料，同时可以减少固体废弃物的排放及对环境的污染。

废纸主要由纤维素（40%～80%）、半纤维素（5%～15%）及少量的木质素组成[3]。近年来的研究发现，利用多种技术可将废纸转化为乙醇、甲烷、氢等能源物质[4-6]，为了提高转化率，往往需要物理、化学或酶预处理，从而在一定程度上增加了经济成本，或对环境造成了一定的污染。其中利用酶转化废纸材料具有很多优势，如底物特异性高、能源消费低、环境污染水平低等。然而，昂贵的成本成为纤维素酶制剂应用的瓶颈。近年来，利用农业或者工业废弃物通过液体或固体发酵的方式生产纤维素酶成为研究热点，例如以水稻秸秆、玉米穗、象草、甘蔗渣及生活污水等为底物[7-12]。在纤维素酶的相关研究中，由于真菌能够分泌大量纤维素酶及半纤维素酶，并且会将其分泌到细胞外至培养基中，易于分离纯化，成为重要的研究对象。但是，用真菌单独分解木质纤维素材料往往需要较长时间[13]。近年来的研究发现，复合菌系能够有效降解水稻秸秆、玉米秸秆、柳枝稷及滤纸等木质纤维素材料，但是以液体微好氧条件培养的复合菌系胞外酶活性较低[14-15]。因此，在好氧条件下筛选1组由真菌及细菌共同组成，且能够高效分解废纸并分泌纤维素酶的复合菌系，对废纸的资源化利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 复合菌系的筛选

复合菌系筛选用Mandels固体培养基，配方如下：1.4 g（NH4）2SO4，2.5 g蛋白胨，0.3 g MgSO4·7H2O，2 g CaCO3，2 g KH2PO4，5 mg FeSO4·7H2O，1.6 mg MnSO4，1.7 mg ZnCl2，1.7 mg CoCl2，12 g琼脂，1 L去离子水，调节pH值至7.0。将培养基于121 ℃灭菌30 min后倒平板待用。

菌源于2010年取自北京植物园的土壤、枯枝落叶，加入50 mL灭菌去离子水，于200 r/min振荡20 min，吸取1 mL至上述培养基平板上，将（0.5±0.1） g灭菌的废打印纸盖在培养基表面作为唯一碳源，于30 ℃静置培养。待废纸分解后，将残余部分刮下并置于50 mL灭菌离心管中，加入30 mL灭菌去离子水，混匀后吸取0.5 mL进行转接。淘汰废纸分解效率低的菌系，将分解能力强的复合菌系每隔4～6 d转接1次，直至功能稳定。向培养3 d的复合菌系与分解剩余的纸中加入25%甘油，于-80 ℃保存。

1.2 降解率

通过测定纸的总质量减少量及木质纤维素成分质量减少量，分析复合菌系对废纸的分解能力。将培养3 d的复合菌系通过“1.1”节的方法制备菌液并接种到21个新的培养基上，加入灭菌的废纸培养6 d，从0 d开始每天取样，每次3个重复，于60 ℃烘干48 h后称质量分析纸的分解情况。将残余的纸烘干后剪至5 mm×5 mm大小，装入F57专用袋（Model F57，ANKOM Technology，USA）中，根据ANKOM220型纤维分析仪说明书测定纤维素、半纤维素含量。

1.3 粗酶液的制备及酶活性的测定

在培养期间，收集分解残余的纸制备粗酶液。从平板上刮下分解剩余的纸，加入30 mL灭菌去离子水充分混匀，浸提底物表面的胞外酶，于8 000 r/min离心10 min后所得上清液即为制备好的粗酶液。羧甲基纤维素酶活性及木聚糖酶活性的测定方法参照文献[16]。

1.4 最佳产酶条件

纤维素酶的产生会受培养基pH值、发酵温度及养分等的影响[17]，为了确定复合菌系分解废纸过程中的最佳产酶条件，设置不同培养温度（25～45 ℃）、培养基pH值（5.0～8.0）及培养基种类（Mandels、Hutchinson、Dubos、PCS及PA）。不同培养基养分组成如下。（1）Hutchinson：1 g/L KH2PO4，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L FeCl3，0.1 g/L CaCl2·6H2O，0.1 g/L NaCl，2.5 g/L NaNO3。（2）Dubos：1 g/L K2HPO4，1 g/L NaNO3，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，0.05 g/L Fe2（SO4）·H2O。（3）PCS：5 g/L蛋白胨，1 g/L酵母粉，2 g/L CaCO3，5 g/L NaCl。（4）PA培养基：在1 L去离子水中加入200 g马铃薯条，煮沸5 min，用纱布过滤后加入去离子水将总体积补足至1 L。上述培养基中均加入12 g/L琼脂，调节pH值至7.0，于121 ℃灭菌30 min。在上述不同条件下，复合菌系于接种后4 d取样，测定废纸的减质量及粗酶液酶活性。

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