香菇紫金Ⅰ号产木聚糖酶固体发酵条件及酶学性质研究

【摘要】 以啤酒糟作为主要原料，以香菇紫金Ⅰ号为菌种进行木聚糖酶发酵研究，通过单因素和正交试验确定最佳培养基组分及其配比，并对其粗酶的酶学性质进行了研究结果表明：最适合的固态发酵培养条件为：碳源为啤酒糟：玉米芯：麸皮=6∶[KG-2/3]2∶[KG-2/3]2，15%的酵母膏作为氮源，pH为5是最适反应，三角瓶装装瓶量为5 g/125 mL，25%的接种量 ，为期8d的培养，1∶[KG-2/3]32的料水比粗酶液的最适反应温度为50 ℃，最适pH为5，相对酶活在30～60℃范围内仍保持在80%以上，适应的温度范围较宽

【关键词】 啤酒糟；香菇紫金Ⅰ号；固态发酵；正交实验

0引言

啤酒糟，是以大麦为原料，经发酵提取籽实中可溶性碳水化合物后的残渣啤酒糟含有丰富的蛋白质、氨基酸及微量元素，谢幼梅等（1995）分析指出，啤酒糟干物质中含粗蛋白2513%、粗脂肪713%、粗纤维1381%、灰分364%、钙04%、磷057% ，其中无氮浸出物的主要成分是木聚糖基于此，一些专业科研人员深入的探究了啤酒糟的利用价值，如制备功能性乳酸发酵纤维饮料所需的膳食纤维可从啤酒糟中提取；复合氨基酸营养液、蛋白饲料可利用啤酒糟发酵来生产等[1-3

]

该试验试图在添加其他辅料情况下，以啤酒糟作为主要原料，香菇紫金I号为菌种，在固态发酵条件下，研究了不同培养条件、不同培养基成分对木聚糖酶活性的影响

1材料与方法

1.1材料

（1）菌种香菇紫金I号来自金陵科技学院发酵工艺实验室

（2）原料啤酒糟由青岛啤酒股份有限公司扬州分厂提供

1.2试剂及配置

1.2.1缓冲液

配制浓度为005 mol/L、pH为25～60的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和pH为65～75的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，用精密pH计校正

1.2.2培养基

（1）斜面培养基： 磷酸二氢钾（KH2PO4）1 g、马铃薯200 g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）05 g、蛋白胨10 g、琼脂20 g、VB12粒、葡萄糖20 g、水 1000 mL、自然pH，于121℃下灭菌20 min

（2）液体种子培养基：啤酒糟3g、葡萄糖15g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1 g、蛋白胨10 g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）05 g、马铃薯200 g、水1000 mL、自然pH，于121 ℃下灭菌20 min

（3）固体发酵培养基：硫酸镁005 g、啤酒糟8 g、硫酸铵01 g、磷酸二氢钾005 g、麸皮2 g，水30 mL，自然pH，121 ℃灭菌45 min

1.2.3底物的配制

1%的木聚糖溶液精确称取燕麦木聚糖1 g于小烧杯中，加入约80 mL pH50的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，沸水浴加热至全部溶解，冷却后转移到100 mL容量瓶中，用缓冲液定容，4 ℃贮存备用（不超过3 d）

1.2.4DNS试剂

该试验参考Miller的文献配置DNS试剂

称取10 g DNS溶于去离子水，依次加入10 g氢氧化钠、200 g酒石酸钾钠，加热溶解后，加2 g苯酚、05 g无水亚硫酸钠，搅拌至全部溶解，冷却，定容至1 L，贮于棕色瓶中，1 W后使用

1.3实验方法

1.3.1发酵过程

（1）斜面菌种培养在斜面培养基上接种上香菇紫金I号2块菌丝，于25 ℃ 恒温培养箱进行培养，培养6～7 d

（2）液体种子培养将活化菌丝用无菌液体培养基进行清洗（无菌条件下），清洗后移入装有80 mL液体种子培养基中（在250 mL三角瓶中进行），于25 ℃、160 rmp的恒温摇床中培养 6 d，备固态发酵培养基用

（3）固态发酵于5 g /125 mL三角瓶中进行，在基础发酵培养基中（已灭菌）接种上已发酵好的液体种子，接种量为干料的20%，置于 25℃ 恒温箱中进行培养，培养10 d

1.3.2单因素试验设计

（1）不同碳源配比影响：将碳源分别替换为啤酒糟 6 g、玉米芯 2 g、麸皮 2 g；啤酒糟 8 g 和玉米芯2 g；啤酒糟 10 g

（2）氮源的影响：按培养基干料比的1%的量，考察以下6因素对氮源的影响：硝酸铵、牛肉膏、硫酸铵、黄豆粉、酵母膏、玉米粉

（3）pH不同的影响：考察（基础发酵培养基）起始 pH 分别为 4、5、6、7、8 时对酶活的影响

（4）装瓶量不同的影响：在125 mL 的三角瓶中进行，将基础发酵培养基按3、5、7

、9 g和 11 g装入三角瓶中，考察5 个不同梯度因素的影响

（5）培养天数不同的影响：按5 个梯度来设定7、8、9、10 和 11 d

（6）料水比不同的影响：料水比设定为

1∶[KG-2/3]28、1∶[KG-2/3]32、

1∶[KG-2/3]36、1∶[KG-2/3]40 和1：44

1.3.3正交试验设计

选择碳源及组分配比，氮源添加量，pH，料水比，培养天数进行5因素、4水平的正交实验，见表1，对以上5个因素进行优化

1.3.4粗酶液制备及酶活测定

（1）粗酶液制备：将50 mL 005 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 48）加入到固态发酵好的培养物中，浸泡2 h（40 ℃）后过滤，再取滤液进行冷冻离心，以6000 rmp离心 15 min，取上清液即是粗酶液

（2）木聚糖酶活力测定：于15 mL干燥试管中加入01 mL上清液和19 mL 1%木聚糖溶液，放水浴锅30 min（40 ℃）后，加入30 mL DNS试剂终止反应，然后在沸水浴中进行5 min显色冷却后用去离子水定容至15 mL摇匀于波长520 nm下测定OD值

该文酶活力单位定义：50 ℃、pH 48条件下，每分钟分解1%木聚糖溶液产生1 μg还原糖（以木糖）的酶量为一个木聚糖酶活力即：

1.3.5木聚糖酶酶学性质的研究

（1）酶的最适pH：用pH为3～8缓冲液配制木聚糖溶液，然后分别加入01 mL粗酶液，水浴30 min（30 ℃）后加入30 mL DNS试剂，终止反应，沸水浴5 min显色，冷却后用蒸馏水定容到15 mL，摇匀空白样对照：将酶液稀释沸水浴15 min令其失活，测吸光度（其他条件不变），计算其残余木聚糖酶活力

（2）酶的最适温度：实验分别在 30、40、50、60、70和80 ℃的条件下，按1342方法将粗酶液分底物反应，测粗酶液最适合反应温度（酶活力最高者为 100%）

（3）酶的pH稳定性：将酶液分别用 pH为3、4、5、6、7 和 8 的缓冲液进行稀释，放水浴锅中保温（50 ℃）4 h，按1342方法测定剩余酶活力（酶活力最高者为 100%）

（4）木聚糖酶的热稳定性：酶活力最高者为 100%计，实验分别在 30

、40、50、60、70和80 ℃条件下 将粗酶液放水浴锅中保温1 h，按1342方法测定测粗酶液剩余酶活力

2结果与讨论

2.1固体发酵单因素试验

2.1.1不同配比的碳源对酶活力的影响

由图1可知，单一碳源（即啤酒糟作为碳源时）酶活力比较低，酶活力最高的是混合碳源即啤酒糟、玉米芯与麸皮3者混合物，啤酒糟和玉米芯混合物次之

2.1.2氮源对木聚糖酶活力的影响

由图2可以看出，产木聚糖酶的活力最高的是酵母膏，为促进菌株的产酶加入定量的酵母膏作为氮源是有益的

2.1.3不同pH对产木聚糖酶的影响

由图3可知，产木聚糖酶最高的菌株是pH为5时，偏酸或偏碱都不利于酶活力的提高由此可以看出菌丝细胞内酸碱平衡、分解培养料的营养物质时pH起到一定的调节作用

2.1.4不同装料量对产木聚糖酶的影响

测定不同装料量发酵产物的酶活力，结果见图4

2.1.5料水比对产木聚糖酶活力的影响

由图5可看出，料水比为 1∶[KG-2/3]32 时酶活力最高料水比不同产酶量而不同，菌体的生长、酶活力会因培养基水分太少而受限制；供氧和散热条件会因水分过大而恶化，酶活力不高，菌体生长缓慢因此，木聚糖酶合成的关键因素是培养基的含水量

2.1.6培养天数不同对产木聚糖酶的影响

在基础培养基移入定量的菌种，酶活力从第7 d开始测，一天测一次，结果见图6，培养天数不同酶活力不同，酶活力最高峰出现在第8 d，8 d以后，酶活力与天数成反比，这可能是由于长时间发酵产生了其他代谢产物，从而抑制了酶的活性因此，培养天数以8 d最佳

2.2产酶条件的正交优化

产酶条件的正交实验结果见表2

结果表明：16个处理中，产酶量存在一定的差异影响产酶量因子依次是E﹥D﹥B﹥C﹥A 产酶条件的最优组合为A2B3C2D1E3，即培养基中碳源为啤酒糟∶玉米芯∶[KG-2/3]麸皮 = 6∶[KG-2/3]2∶[KG-2/3]2，氮源为15%酵母膏，料水比为：1∶[KG-2/3]32，最佳培养时间为8 d，在此培养条件下得到的酶活力最高

由图8可知，木聚糖酶活力在50 ℃ 达到最高值，50 ℃之前随着温度的升高而增加，速度比较快，60 ℃后酶活力开始下降，下降速度很快因此，木聚糖酶的最适反应温度为50 ℃

2.3.3酶的pH稳定性

按照1353方法进行实验，结果见图9

由图9可知，木聚糖酶在pH为5时酶的相对酶活力达到最高值，几乎为100%，在pH为

4～6范围内酶活性较为稳定，而且在pH为4～8范围内酶活力仍保留在50%以上，表明该酶系中可能有多种组分存在，因此该酶具有一定的耐酸和耐碱能力

2.3.4酶的热稳定性

按照1354方法进行实验，结果见图10

由图10可知木聚糖酶在40℃时酶的相对活力是100%，而且在30～60℃的范围内，相对酶活力仍保持在80%以上，说明该酶具有广泛的热稳定性

3讨论

由正交试验设计可以看出，对木聚糖酶活力的影响因素依次为培养时间、料水比、氮源、pH 和碳源，培养基初始 pH对木聚糖酶的合成有较大影响，但在正交实验中，pH并不是主要的影响因素，因此，在生产中为控制培养基中的 pH 变化可以在固体培养基中加入一些缓冲剂

4结论

香菇紫金I号以啤酒糟为主要原料产木聚糖酶的优化碳源为：啤酒糟∶[KG-2/3]玉米芯

∶[KG-2/3]麸皮=6∶[KG-2/3]2∶[KG-2/3]2，氮源为15%的酵母膏，pH为5，装瓶量5 g/125 mL三角瓶装，接种量 25%，培养天数8 d，料水比1∶[KG-2/3]32

通过实验得出相关酶学性质，50 ℃是酶的最佳反应温度，最适pH为5，在pH为4～8范围内酶活力仍保留在50%以上，酶的相对活力是100%的温度为40 ℃，相对酶活在30

～60 ℃仍保持在80%以上

参考文献

[1]曾莹，向新柱发酵啤酒糟高产饲用木聚糖酶菌种的诱变选育[J]饲料工业，2005，26（18）：21-23

[2]王金华，郭健啤酒糟膳食纤维饮料的研制[J]粮油食品科技，2003，11（3）：18～19

[3]蔡俊啤酒糟发酵生产蛋白饲料的研究[J]粮食与饲料工业，2001，3：30-31

[4][ZK（#]费笛波，冯观泉，袁超饲用木聚糖酶活性测定方法的研究[J]浙江农业学报，2004，16（2）：53-58

[5]Miller G LUse of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]Anal Chem，1959，31（3）：426-428

[6]Boeehini D A， FAlvesPradoa， H Optimization of xylnaase Production by Baeilluseireulnas DIinsubme gredefmrentationusingers Ponsesurafcemehtodology Process Biochemirtsy，2002，38：727-731

（责任编辑：李家云）

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