木聚糖酶在白酒酿造中的应用研究

材料与方法

1.1 材料

玉米粉：市售;酿酒酵母：常德职业技术学院生物实验室保藏菌种;木聚糖酶：诺维信公司。

1.2 分析方法

1.2.1 酒度测定方法

准确量取100 mL发酵液加入500 mL蒸馏瓶中，再加入100 mL蒸馏水后置于蒸馏装置上，开启冷却水，用100 mL容量瓶收集流出液，收集约96 mL流出液时，取下容量瓶，补水定容至100 mL，混匀后倒入100 mL量筒中，用酒精计（标温20 ℃）测定酒精度（下缘为准），同时测定温度，然后换算成20 ℃时的酒度。

1.2.2 还原糖测定

（1）斐林试剂标定。吸取斐林试剂甲、乙液各

5 mL，置入250 mL三角瓶中，加10 mL水，并从滴定管中预先加入约20 mL 0.1%标准葡萄糖溶液（其量控制在滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液1 mL以内），摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4～5 s/滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需要在1 min内完成，总消耗量为V0。

（2）预备实验。吸取斐林试剂甲、乙液各5 mL，置于250 mL三角瓶中，加入V1试样稀释液（含葡萄糖5～15 mL）及适量的0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V2。

（3）正式实验。吸取斐林试剂甲、乙液各5 mL，置入250 mL三角瓶中，加入体积V1试样稀释液和（V2-V1）0.1%标准葡萄糖溶液，补加[（V0+10）-（V2+V1）]水，摇匀，以下同标定时操作，总耗糖量为V。依据公式（1）计算。

还原糖（以葡萄糖计%）=式中：V0-斐林试剂标定值，单位为mL;V-斐林试剂测定值，单位为mL;C-标准葡萄糖溶液浓度，单位为g·mL-1;n-稀释倍数;V1-所取试样稀释液体积，单位为mL。

1.2.3 CO2失重的测定

二级种子接入发酵培养基后，用天平称量发酵瓶，在整个发酵过程中，每隔12 h称重一次，称量前要先摇晃瓶子，以赶除CO2，直到每天失重不超过1.0 g，即表示发酵基本结束，每个处理做3次重复，取平均值。

1.2.4 原料出酒率

按照中国酿酒工业协会定义，标准大气压，20 ℃，一个单位所产出的含量为50%的酒精产量即为该单位的出酒率。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米水解液的制备

①准备60～70 ℃的热水1 250 mL与500 g玉米粉混合调浆，放置一段时间，使玉米粉颗粒充分吸水膨胀。②加入耐高温α-淀粉酶0.3 mL在85～90 ℃

水浴中液化90 min。③降温至60 ℃，加入糖化酶

1 mL，在55～60 ℃水浴中糖化20 h。④滤布过滤后，121 ℃下灭菌15～20 min。

1.3.2 玉米带渣发酵基础培养基的制备

将50 g玉米粉用60～70 ℃水按一定料水比混合调浆，置于250 mL三角瓶中浸泡一段时间。加入耐高温α-淀粉酶0.03 mL，在85～90 ℃水浴中液化90 min。

糊化醪冷却至60 ℃，加入糖化酶0.1 mL在55～60 ℃水浴中，糖化30 min。添加复合盐离子溶液0.1 mL。冷却至室温，添加相应的辅助酶制剂进行酒精发酵。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶添加量对液态发酵的影响

在发酵培养基料水比为1∶2.5，pH为自然pH，木聚糖酶在接种前添加的条件下，分别加入0、130、150、170 U·g-1和190 U·g-1木聚糖酶进行实验，发酵72 h后，测定发酵醪的理化指标，结果见表1。

由表1中的CO2失重情况可知，添加一定量的木聚糖酶可以显著提高发酵速度，同时酒度和原料出酒率随着酶量的增加而增加，当添加量为170 U·g-1时，酒度达最大，原料出酒率比对照高，此后再增加酶的用量，虽然发酵速率有所提高，但酒度不再变化。因此，从节约成本角度考虑，选择170 U·g-1的木聚糖酶用量較为适宜。但考虑其他因素的影响，选择150、170、190 U·g-1进行正交试验。

2.2 发酵培养基中料水比对液态发酵的影响

在发酵培养基木聚糖酶添加量为150 U·g-1，pH为自然pH，木聚糖酶在接种前添加的条件下，分别调整料水比为1∶2.2、1∶2.5、1∶2.7、1∶3.0进行实验，发酵72 h后，测定发酵醪的理化指标，结果见表2。

由表2可知，当料水比为1∶2.2时，酒度达最大，此后再增加料水比，酒度逐渐降低。可能的原因是当料水比逐渐增高时，发酵液中溶氧水平下降，使酵母细胞耐受酒精能力下降，最终导致发酵不彻底。根据实验结果，选择1∶2.2的料水比较为适宜。但考虑其他因素的影响，选择1∶2.2、1∶2.5进行正交试验。

2.3 发酵培养基初始pH值对液态发酵的影响

在发酵培养基木聚糖酶添加量为150 U·g-1，料水比为1∶2.5，木聚糖酶在接种前添加的条件下，分别调整pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5及自然pH（6.0左右）进行实验，发酵72 h后，测定发酵醪的理化指标。结果见表3。

由表3可知，随着pH的增大，酒度呈现先增大后减小的趋势，当pH值为5.0时，酒度达最大。产生这种情况的原因可能是酵母发酵需要酸性环境，pH为5.0一方面可以促进酵母的生长及发酵，另一方面，又可以抑制其他杂菌的生长。但是，酸性过低又会抑制酵母的生长及发酵效率。因此，选择pH 5.0比较适宜。但考虑其他因素的影响，选择pH 5.0、pH5.5、自然pH进行正交试验。

2.4 正交试验

在单因素试验基础上，选择木聚糖酶添加量、料水比、pH值及添加时间为正交表考察因素，选择L9（34）正交表进行试验。以酒度为考察指标，运用极差法分析试验结果。正交试验设计见表4，结果见表5。

分析结果表明，因素的主次顺序为C>A>B>D，因素最佳组合水平为C1A2B2D3，即木聚糖酶添加量为170 U·g-1，料水比为1∶2.2，接种前加入木聚糖酶以及自然pH。按照最佳组合为C1A2B2D3，即木聚糖酶添加量为170 U·g-1，料水比为1∶2.2，接种前加入木聚糖酶以及自然pH进行验证实验。对正交实验结果进行验证，验证实验结果为酒度为14.45%、残糖含量为0.03 g·L-1，故应用正交表所得出的结论是正确的。

2.5 发酵周期的确定

在正交试验的基础上，进行发酵周期的确定。分别选择12、24、36、48、60 h和72 h六个时间段进行试验，每个时间段结束时测定发酵醪的理化指标，结果见图1。

由图1可知，在整个发酵过程中，添加组的发酵效率明显快于对照组，随着发酵时间的延长，酒度呈现先增大后减小最终趋于水平的趋势，当发酵时间为48 h时，酒度达最大。发酵周期缩短了24 h。其作用原理可能是在木聚糖酶的作用下，原料的细胞壁被进一步破坏，使得可发酵的内容物更利于与其他酶类如糖化酶，充分接触发挥作用，从而加快了发酵速率，缩短了发酵周期。

2.6 不同种类及浓度的离子对发酵的影响

酵母等微生物在生长过程中需要依靠无机盐来维持细胞的渗透压，同时各种矿物质元素如钙、铁、锌、锰等对酶及酶活等的作用有着重要影响[4-8]。

在上述实验优化结果的基础上，分别添加4、8、12 mmol·L-1的Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+ 4种离子，考察不同浓度的金属离子对酒精发酵的影响。

2.6.1 Ca2+添加量对酒度的影响

由图2可知，添加终浓度为4 mmol·L-1及8 mmol·L-1的Ca2+对酒精发酵有明显的促进作用。当添加的Ca2+终浓度为8 mmol·L-1时效果最好，但当添加的Ca2+终浓度为12 mmol·L-1时对酒精发酵反而起到抑制作用。

2.6.2 Mn2+添加量对酒度的影响

由图3可知，当添加的Mn2+终浓度为4 mmol·L-1时，对酒精发酵有微弱的促进作用，但当Mn2+终浓度超过4 mmol·L-1时，开始对酒精发酵产生抑制作用。

2.6.3 Zn2+添加量对酒度的影响

由图4可知，当Zn2+终浓度大于4 mmol·L-1时，即对酒精发酵产生抑制作用。随着Zn2+终浓度的增加，抑制作用越来越明显。产生这种现象的原因可能是不同浓度的Zn2+均对木聚糖酶的活性产生抑制作用，从而导致了酒度的下降。

2.6.4 Fe3+添加量对酒度的影响

由图5可知，同Zn2+相似，当Fe3+终浓度大于

4 mmol·L-1时，即对酒精发酵产生抑制作用。随着Fe3+终浓度的增加，抑制作用越明显。产生这种现象的原因可能同样是所加入的各种浓度的Fe3+对木聚糖酶的活性产生了抑制作用，致使酒度下降。

2.6.5 小结

向培养基中添加Ca2+至终浓度为8 mmol·L-1时，可以明显增加酒度，但继续增加Ca2+浓度至12 mmol·L-1时，会对酒精发酵产生抑制作用。而Mn2+对酒精发酵的影响不是很明显。当添加不同浓度的Zn2+和Fe3+时，反而对酒精发酵有较强的抑制作用。因此，可在玉米带渣发酵培养基中加入终浓度为8 mmol·L-1的Ca2+进行试验。

2.7 验证试验

根据2.4、2.5及2.6优化结果，进行酒精发酵验证实验，结果见表6。可以看出，添加木聚糖酶后酒度是对照组的130.47%。添加组残糖含量是同一时期对照组残糖含量的7.4%。

3 结论

木聚糖酶在白酒生产中的最佳试验条件：在发酵开始时加入木聚糖酶170 U·g-1;发酵培养基料水比为1∶2.2;发酵培养基初始pH为自然pH;添加Ca2+溶液终浓度为8 mmol·L-1;发酵周期为48 h。

经过发酵培养后，添加木聚糖酶后酒度是对照组的130.47%，添加组残糖含量是同一时期对照组残糖含量的7.4%。由优化后的结果可知，不论是在酒度还是在残糖方面，木聚糖酶在玉米酒精发酵中均具有较大的优势。

参考文献：

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[2]马文静，张美云，房桂干.木聚糖酶的应用研究[J].江苏造纸，2008（1）：20-24.

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