橡胶树树皮和木质部淀粉和可溶性糖含量测定

摘 要 提出一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法。取样测定范围为10～200 mg，利用80%乙醇浸提提取可溶性糖，硫酸蒽酮法测定可溶性糖含量，硝酸钙法提取淀粉，I2-KI法测定淀粉含量。本方法优点是：取样量小，对胶树伤害小，取样过程简单，测定结果准确。

关键词 橡胶树 ；非结构性碳水化合物 ；可溶性糖 ；淀粉

分类号 S794.1

A Method for Measuring Soluble Sugars and Starch in Bark

and Xylem of Rubber Tree

WEI Fang1） ZHENG Qiankun2） LUO Shiqiao1）

QIU Jian1） YANG Wenfeng1） WU Ming1） XIAO Xianzhou1，2）

（1 Rubber Research Institute / Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China；

2 College of Agriculture， Hainan University， Haikou， Hainan 570288， China）

Abstract A method for measurements of non-structural carbohydrates in bark and xylem of rubber tree was put forward in this study. The measuring sample was within 10-200mg， soluble sugars extracted by 80% ethanol and measured by Sulfuric acid-anthrone method， and starch extracted by Ca（NO3）2 method and measured by I2-KI. Merits of this study： little sample with little hurt to rubber tree， simple operating and accurate data.

Keywords rubber tree ； non-structural carbohydrates ； soluble sugars ； starch

非结构性碳水化合物（non-structural carbohydrates，NSC）是光合作用的主要产物，包括可溶性糖（如蔗糖、葡萄糖、果糖等），以及储藏的淀粉和脂类。一旦被同化，非结构性碳水化合物被分配用于植物本身代谢、新组织生长、产生保护性化合物，或者储存以备后用[1-2]。当植物对碳水化合物的需要超过光合作用的供应后，储藏的NSC将会提供必要的缓冲，这种情况例如，在夜间无光合作用时，休眠季节或者环境压力和面对伤害时[3]。成年树木包括大量NSC[4]，数量是可以顶盖植物叶子重新生长的几倍之多[5-6]，传统观点认为，NSC的储藏是一个被动的过程，认为在这个过程中满足植物需求之后多余的碳源才会被储藏[1]。然而，NSC的储藏也可以看做是一个主动的过程，这个过程中，NSC根据生长价值进行分配，这也是一种进化适应，这种适应是长期应对不同的气候、疾病或者其他外界打扰的压力所形成的[7]。

巴西橡胶树是一种具有重要经济价值、依靠结构独特乳管系统进行产胶的多年生热带高大乔木，橡胶生物合成是其乳管中最主要的代谢活动，其生产的天然橡胶（顺式多聚异戊二烯）有重要的商业、国防和交通工业原料。在橡胶树中NSC主要储藏形势是淀粉，淀粉的动员对于胶乳再生和补偿持续割胶伤害有不可忽略的作用。木质部中淀粉可以看做一种长效储存源，而树皮中淀粉只是作为即时的缓冲。木质部中的可溶性糖作为一个转运库，树皮中的可溶性糖可以被看做一种中间的、随时准备被使用的储藏[8]。一直以来，由于淀粉并不是合成橡胶的直接原材料，关于淀粉方面的研究较少。近年来发展起来的刺激割胶大大提高了橡胶产量，但是由于割胶强度较大，不可避免的需要动员储藏碳库来提供原料供应，这个过程中淀粉的作用不可忽略。淀粉的积累和消耗的动态变化情况对于割胶刺激剂的施用和割胶强度的调整有重要的意义，是重要的割胶理论基础。在此条件下掌握橡胶树树皮和木质部的可溶性糖和淀粉提取和测定方法是解决这项工作的前提。

目前，人们对于树木淀粉提取的研究较少，在我国，20世纪80年代初期梁尚朴对橡胶树树木的淀粉含量进行过测定，由于条件限制，当时使用割胶后的树皮直接染色后按照颜色深浅分级，肉眼分辨淀粉的等级，该方法没有将淀粉含量定量，也没有测定木质部淀粉含量。对木本植物淀粉研究较少，在国外，加拿大研究人员对于杨树和松树的叶子和根的淀粉进行提取和测定，采用的是酶解的方法[9]，由于该方法操作过程步骤较多，花费时间长，需要的样品量较多，对于橡胶树而言，树皮是割胶的保证，尽量保护试验用树也是保障后续试验能顺利进行的基础，因此，所述方法并不适合于橡胶树的树木淀粉检测。建立橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物提取及含量测定方法，尽量减少取样过程中对树皮的伤害成为本领域需要解决的技术问题，目前，关于这方面的技术成果，并未见诸报道。

1 材料与方法

1.1 材料

2012年7月10号对中国热带农业科学院试验场七队定植于1982年的一颗无性系PR107取样，选择离地面不同高度处割面一侧取树皮和木质部。

1.2 方法

1.2.1 取样

取样橡胶树树皮用直径0.5 cm小型打孔器，直接用手将打孔器戳进树皮内，从树皮中取出相应树皮，作为树皮样品；再在树皮取样口用小型电钻在木质部打孔部位钻孔取样木屑，作为木质部样品，钻孔深度为3.0 cm。

1.2.2 可溶性糖提取和测定

分别对树皮和木质部样品液氮研磨，烘干后取10～200 mg，0.5～4 mL 80%乙醇80℃浸提40 min，中间斡旋搅拌，12 000 r/min离心10 min，收集上清，残渣加80%乙醇重提一次，合并上清，上清中加入活性炭10 mg，80℃脱色30 min，离心后取清液定容至10 mL，分别获得树皮和木质部的可溶性糖提取液；取100 μL加入3 mL硫酸-蒽酮试剂，90℃保温15 min，冷却至室温后626 nm处测定光吸收。

1.2.3 淀粉提取和测定

将提取可溶性糖后的树皮和木质部沉淀残渣分别用2 mL 80%Ca（NO3）2溶液沸水浴5 min浸提，4 000 r/min离心5 min，收集上清，残渣用2 mL80%Ca（NO3）2冲洗一次，离心收集上清，合并提取液，分别获得树皮和木质部淀粉提取液。提取液2 mL，加入100 μL I2-KI溶液，在580 nm处测定光吸收。

1.2.4 可溶性糖和淀粉测定方法及最大光吸收测定

配置80%乙醇溶液及浓度为1 mg/mL的葡萄糖（还原性糖）和蔗糖（非还原性糖）溶液；150 mg蒽酮溶于100 mL稀硫酸（70 mL浓硫酸加30 mL水）配制成蒽酮试剂。蔗糖与葡萄糖溶液按比例混合（混合比例如下表），混合液100 μL加入3 mL蒽酮试剂，90℃保温15 min，冷却至室温后在300～900 nm扫描光吸收。

1.2.5 可溶性糖和淀粉标准曲线测定

用硫酸-蒽酮法测定不同浓度梯度可溶性糖在626 nm光吸收下的标准曲线，选取的可溶性糖浓度分别为：0、200、300、400、600、800、1 000 μg/mL，取100 μL加入3 mL硫酸-蒽酮试剂，90℃保温15 min，冷却至室温后626 nm处测定光吸收。以光吸收测定值为横坐标，可溶性糖浓度为纵坐标绘制标准曲线。

不同浓度（0、50、100、200、300、400 μg/mL）淀粉溶液2 mL，加入100 μL I2-KI溶液，在580 nm处测定光吸收，以光吸收测定值为横坐标，淀粉溶液浓度为纵坐标绘制标准曲线。

选取一株胶树进行可溶性糖和淀粉含量测定。

2 结果与分析

2.1 硫酸蒽酮法测定可溶性糖最大光吸收峰

从表1中可以看出，采用硫酸蒽酮法测定可溶性糖含量光吸收在626 nm合适。由于淀粉的溶液的成分单一，本文默认反应液的最大光吸收峰在580 nm处。

2.2 标准曲线

2.3 树皮和木质部可溶性糖和淀粉含量

根据标准曲线，选取一株胶树进行实验，结果表明，试验数据均在测定区间范围内，以上数据可信度高。根据图3的样品可溶性糖和淀粉浓度含量进行比较分析，由于割线位于地上1 m左右，无论是树皮还是木质部，割线处可溶性糖含量显著高于非割线处，说明在割线处产胶潜力最大，也间接说明割胶引起了可溶性糖向割线处聚集；其次，被测胶树的树皮中淀粉含量显著低于木质部中淀粉含量，说明木质部内淀粉作为长效储存源含有较多的淀粉，而树皮中淀粉只是作为即时的缓冲；实验结果表明，该取样树已经割胶20年，虽然已进入老龄但是对比淀粉和可溶性糖含量，该树在现阶段的常规割胶制度下仍有产胶潜力，可以持续割胶。

3 讨论

传统的I2-KI测定方法多用于测定产淀粉植物中的淀粉，在进行橡胶树树皮和木质部淀粉测定过程中，由于色素的影响，提取液数据重复性差，本方法在此基础上添加了活性炭，并对活性炭添加质量和脱色时间及条件也进行了摸索，认为10 mL体积内，加入10 mg活性炭，80℃高温脱色30 min以上效果最好。根据橡胶树木质部和树皮淀粉含量的范围，对提取和测样体积也进行了摸索，10～200 mg样品，可溶性糖提取体积在10 mL以内，测样体积100 μL，淀粉提取体积在10 mL内，测样体积2 mL。对树皮和木质部的可溶性糖提取后的残渣和原始样品进行淀粉提取后发现，两种方法淀粉含量差别无几，所以用残渣进行淀粉提取更方便更节约树皮。

割胶使得橡胶树不仅需要补充乳管胶乳的再生，同时橡胶树还需要承受割胶造成的持续伤害，伤害引起的胁迫增加了胶树的呼吸作用，也需要消耗碳水化合物[10]。Silpi U.等[11]研究表明所有开割后的胶树，储藏的增加伴随的是胶树树干生长的显著降低，储藏的碳源能量被用于胶乳再生和补偿割胶引起的持续伤害 。另一方面，Chantuma P.等[8]认为割胶也使得树干积累更多的非结构性碳源，淀粉在树皮中的含量低于树干，但是可溶性糖含量反而是树皮高于树干，虽然胶乳再生发生在树皮，但与割胶紧密相关的是树干的淀粉含量而不是树皮。该研究还认为储藏淀粉的动态变化可以作为评价割胶制度的一个相关参数。鉴于种种研究，我们认为对橡胶树树干可溶性糖和淀粉含量规律是重要的割胶理论基础，在此前提下，本文确定了一种微量取样测定橡胶树树皮和木质部淀粉和可溶性含量的方法，其优点在于只需要在不伤害橡胶树割胶的基础上，取少量树皮和木质部（最低取样10 mg）进行可溶性糖和淀粉含量测定，对橡胶树的树皮和木质部伤害较小，而橡胶树的耗皮是橡胶树稳产高产的保证，节约橡胶树耗皮量可以延长割胶时间，提高橡胶树经济价值；能够快速获得树皮和木质部中蔗糖和淀粉的含量，为每年开割初期准确确定橡胶树开割时间、制定不同无性系橡胶树在植胶区不同物候下的含量标准、评价橡胶树割胶潜力提供技术支持，与淀粉酶解法相比，不仅步骤简单，耗时短，而且对橡胶树伤害小，实际应用时具有明显的技术优势。

参考文献

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[10] Uritani I， Asahi T. Respiration and related metabolic activity in wounded and infected tissues. Biochemistry of plants： a comprehensive treatise[J]. 1980（2）： 463-485.

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