巴西橡胶树乙醇酸氧化酶HbGOX1基因的鉴定与表达分析

摘 要 光呼吸途径是植物中重要的反应途径，它通过消耗光合作用产物影响作物的产量。乙醇酸氧化酶是该途径的关键调控酶，在橡胶树中尚未见研究报道。本研究分离和鉴定橡胶树HbGOX1基因的全长cDNA序列，对其编码的蛋白质进行生物信息学分析，并通过qPCR技术进一步研究HbGOX1基因在低温胁迫下的表达情况。结果发现，该基因受低温胁迫负调控。此结果为进一步揭示橡胶树光呼吸途径在橡胶合成中的作用奠定了基础。

关键词 橡胶树 ；低温应答 ；光呼吸途径 ；HbGOX1基因

中图分类号 S794.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.08.005

Abstract Photorespiratory pathway is an important metabolic pathway in plant，which consumes the products of photo-synthesis and reduces crop final yield. Glycolate oxidase is the key regulatory enzyme of this pathway， while the study in rubber tree is absence. In this study， the cDNA sequence of HbGOX1 gene was identified and characterized， and the peptide sequence was analyzed bioinformatically. The expression pattern of HbGOX1 gene was further explored under cold stress. The results showed that this gene was negatively regulated by cold stress. This study provided some fundenmental information for the roles of photorespiration in rubber biosynthesis in Hevea brasiliensis.

Keywords rubber tree ； cold responding ； photo-respiration pathway ； HbGOX1 gene

巴西橡胶树是天然橡胶的主要来源。20世纪中国成功在北纬18°大规模种植橡胶树，并建立了海南、云南和广东三大植胶区，基本保障了中国对天然橡胶的需求[1]。然而，由于巴西橡胶树起源于热带，对低温极其敏感，加上中国植胶区处于热带北缘，时常受冬季寒流的影响。除寒害外，中国植胶区还受旱害、台风和贫瘠等非生物胁迫的威胁。这些因素已经成为限制中国植胶事业的重要限制因子。因此，培育抗逆橡胶品种、研究橡胶树抗逆的生物学机理、发展抗逆栽培方法是中国植胶事业亟待解决的研究内容。

天然橡胶是由聚异戊二烯分子构成。在橡胶树中，通过光合作用合成碳水化合物并运输至乳管细胞中，再通过萜类合成途径进一步合成橡胶烃分子。光合作用是天然橡胶生物合成的物质和能量来源[2-5]。植物细胞中的光合作用是通过核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）复合物催化进行，该酶同时具有催化羧化和加氧的功能。前者为催化吸收二氧化碳，合成糖类物质；后者则通过氧化作用，进入光呼吸途径，消耗掉光合作用的产物[6-8]。除光合作用外，光呼吸途径是影响积累生物量的主要因素之一。

乙醇酸氧化酶（glycolate oxidase，GOX）是光呼吸途径中的关键调速酶，该酶催化乙醇酸氧化形成乙醛酸，释放过氧化氢[7，9]。乙醇酸氧化酶一方面调控光呼吸途径，另一方面它释放的活性氧分子调控植物非寄主抗病性的信号转导途径[10]。在植物中，该酶活性的缺失往往造成致死突变，如在玉米中，GOX基因的突变株只能在高浓度二氧化碳的空气中存活[11]。目前，在植物中，对乙醇酸氧化酶所催化的反应和参与的途径都有比较深入的研究，然而对于该基因在光合物质积累的影响却研究较少。在全球气候变暖和温室气体浓度上升的大背景下，气候变化对植物光呼吸途径及与农作物产量都产生了深远的影响。因此，研究光呼吸途径在非生物胁迫下的反应情况显得十分重要。乙醇酸氧化酶基因作为光呼吸途径的关键调控基因，它的应答情况对光呼吸作用有着重要的影响。笔者从橡胶树中分离乙醇酸氧化酶基因（HbGOX1），并鉴定该基因的特性和表达特征，为进一步阐述橡胶树光呼吸途径在橡胶合成中的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验Solexa测序的材料来自巴西橡胶树抗寒品种93-114，嫁接苗保存于中国热带农业科学院橡胶研究所苗圃内，待第一蓬叶稳定后，搬回实验室中，放置于人工气候箱中培养。培养条件：25℃，16 h光照/8 h黑暗。经过一周适应性培养后，转移至4℃的低温培养室进行低温处理。分别在0、2、8和24 h取样，提取总RNA，送交北京百迈客生物公司进行转录组测序分析。

菌种、Taq酶、pUCm-T载体、DNA凝胶回收试剂盒、AMV逆转录酶、T4 DNA连接酶等分子生物学试剂和qPCR试剂盒均购自大连宝生物公司。所有引物及测序均由广州英骏生物公司完成。其他生化试剂为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 HbGOX1基因及其生物信息学分析

使用拟南芥AtGOX1基因的编码蛋白质序列，对拼装好的橡胶树低温诱导转录组进行TBLASTN搜索，结果发现1条Unigene序列与AtGOX1基因高度同源。使用该序列，利用转录组数据进行电子克隆，得到一个完整的HbGOX1全长cDNA序列。

HbGOX1基因的ORF预测通过NCBI的ORF Finder（http：///）对HbGOX1的外显子/内含子基因结构进行分析。利用MEGA软件对橡胶树和其他高等植物的GOX1蛋白的氨基酸序列构建系统发育树[12]，采用Neighbor-Joining方法进行1 000次bootstrap统计学检验。

1.2.3 基因的表达模式分析

基因表达采用qPCR方法。橡胶树抗寒品种93-114幼苗经过0、0.5、2、8和24 h的低温处理，提取叶片总RNA，经过DnaseI消化、反转录后，进行qPCR分析[13]。以橡胶树18S rRNA基因为内参，采用ΔΔct法进行定量分析。每个样品经过3个生物学重复和3个实验学重复，确保实验结果数据的一致性。表达数据经过student t-test进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 HbGOX1基因的鉴定和序列特征分析

通过同源性搜索，从橡胶树低温诱导转录组RNA-seq数据拼接的Unigene中发现1条与拟南芥AtGOX1高度同源的DNA序列片段。使用该序列在转录组数据中进行电子延生，得到一条完整的全长cDNA序列，初步命名为HbGOX1。该序列cDNA长度为1 589 bp（图1-A），使用NCBI的ORF Finder工具从HbGOX1的cDNA序列上发现1个1 101 bp的编码区，推测编码367个氨基酸的蛋白质。对该多肽序列进行初步分析，结果发现其中存在着1个黄素单核苷酸（FMN）结合催化激活位点（图1-B）。该位点是乙醇酸氧化酶家族所共有的结合位点，也反映该酶在催化反应过程中需要FMN辅基的参与。

根据HbGOX1基因的电子序列设计引物，从橡胶树cDNA中扩增HbGOX1的cDNA片段。结果显示，扩增到的DNA片段长度约为1.5 kb（图2）。克隆后送交测序，并和原电子序列进行比对，结果发现，该DNA片段的序列与电子序列一致。表明从转录组数据中发现的HbGOX1序列为真实基因的cDNA序列。

2.2 HbGOX1基因的结构分析

利用HbGOX1基因全长cDNA序列，搜索比对橡胶树全基因组数据库，获取橡胶树HbGOX1基因的结构信息。由图3可知，HbGOX1基因长度为5 810 bp（不包括上下游调控序列），共由12个外显子和11个内含子组成，结构较为复杂。其中最大的外显子为536 bp，最小的仅为47 bp。复杂的结构和较短的外显子也表明，该基因很有可能在转录后受RNA剪切水平的调控[14]。

2.3 HbGOX1编码多肽序列特征分析

利用EMBOSS的PEPSTATS 工具对推测的HbGOX1蛋白进行初步分析，结果发现，该推导多肽共有367个氨基酸残基，分子量约为40.4 ku，等电点为9.44，为碱性蛋白质。通过SignalP 4.1程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和ProtScale程序（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）对HbGOX1多肽序列进行信号肽和疏水区搜索，结果发现，该蛋白的N端不存在明显的信号肽，也没有明显的跨膜区域。然而，查看HbGOX1蛋白的C末端，发现存在1个PRL三氨基酸残基的PTS1信号肽（图1-A）[15]，表示该蛋白将被定位到过氧化物酶体中。用Psort程序（http：//psort.hgc.jp）对HbGOX1蛋白的亚细胞定位进行可能性预测分析，结果表明，该蛋白质主要分布在细胞质和过氧化物酶体中，也会分布到溶酶体和线粒体中（表1）。

2.4 HbGOX1蛋白进化分析

将橡胶树HbGOX1编码蛋白序列与来自麻风树（Jatropha curcas，XP_012072124.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002519658.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana， NP_188060.1）、巨桉（Eucalyptus grandis， XP_010060801.1）、番茄（Solanum lycopersicum， NP_001294871.1）、大豆（Glycine max， NP_001241302.1）和莲（Nelumbo nucifera， XP_010275857.1）等7种植物的GOX1蛋白质进行比对，结果见图4。在这8种植物中，GOX1的蛋白质序列高度相似，HbGOX1与其他植物的GOX1相似性均在90%以上。表明GOX1蛋白质在高等植物中的保守性较高，可能与该蛋白功能上的保守性有关。

利用MEGA 6.0软件对橡胶树和其他7种植物的GOX1蛋白质的氨基酸序列构建系统发育树，采用Neighbor-Joining方法进行分子系统学分析，并进行1 000次bootstrap统计学检验[12]。结果表明，橡胶树的GOX1蛋白与同样来自大戟科的麻风树和蓖麻亲缘关系较近，分布在一支上，而拟南芥、番茄、桉树和莲等分布在另一支，大豆则单独成为一支（图5）。

2.5 HbGOX1基因表达特征分析

橡胶树受低温胁迫时，光系统受到伤害，光合作用停止[16]。然而光呼吸系统是否也受到影响不得而知。笔者利用qPCR技术对橡胶树HbGOX1基因在低温胁迫下的表达情况进行研究，以分析光呼吸系统在低温胁迫下的应答情况，结果见图6。HbGOX1基因的表达在橡胶树受低温胁迫后持续降低，2 h后达到显著性差异，其后一直维持在较低水平。其中在低温胁迫8 h后有一个短暂上升，但仍然处于较低水平。这表明橡胶树HbGOX1基因受到低温胁迫的负调控。

HbGOX1作为光呼吸途径中的关键调控基因，其表达水平的高低影响了光呼吸途径的效率。HbGOX1基因受到低温胁迫的负调控，表明橡胶树在低温胁迫时，降低HbGOX1基因的表达，以降低光呼吸途径效率，这与光合作用效率在低温胁迫下降低是一致的。表明橡胶树在低温胁迫时，降低了光合作用和光呼吸，最大限度的降低能量消耗。

3 讨论与结论

乙醇酸氧化酶是植物光呼吸途径中的关键调速酶，通过调控光呼吸途径而调节光合作用产物的积累，因此对农作物生物量和产量有着重要的影响[7-8，17]。以前人们往往把光呼吸途径当成植物中消耗能量的浪费步骤，因而想方设法降低光呼吸途径的效率，从而提高植物最终生物量的积累[8]。然而，近些年的研究结果发现，光呼吸途径对植物发育有着重要的影响。首先，光呼吸途径中的乙醇酸氧化酶所催化的反应释放大量过氧化氢，而过氧化氢又作为信号分子参与植物发育的各个阶段[9]。第二，乙醇酸氧化酶还通过降解乙醇酸在植物中的积累来减低乙醇酸对植物的毒害。在植物中，光呼吸途径的突变体往往都表现出条件致死表型——在高浓度二氧化碳的气体中存活，而在平常浓度的空气死亡。因此，乙醇酸氧化酶基因除了催化植物中最大的产生过氧化氢的反应外，还有可能参与植物发育的各个方面，然而这方面的研究还较为欠缺。

巴西橡胶树是天然橡胶的主要来源，天然橡胶的合成依赖于光合作用合成的大量蔗糖物质。通过运输到乳管细胞中进行聚异戊二烯分子的合成。由于橡胶树对低温极其敏感，在15℃左右，橡胶树的光合作用就趋于停止[16]。而光呼吸作为消耗光合作用能量的副反应，其效率水平则直接影响橡胶树中有机物的消耗。另外，已有研究结果表明，橡胶树在低温胁迫时，释放大量的活性氧自由基[18]，光呼吸途径中的乙醇酸氧化酶反应是否参与这个过程也不得而知。基于上述2个原因，研究橡胶树中GOX基因的功能，特别是该基因对于低温的反应就显得十分重要。通过分析橡胶树GOX基因在低温胁迫下的表达特征，进而推测橡胶树在低温胁迫下的光呼吸途径变化，为研究橡胶树低温胁迫下的生理反应提供更多信息。

本研究通过分析RNA-seq数据，从橡胶树中获得了一条乙醇酸氧化酶基因，通过分析该基因及其编码的蛋白质的序列特征、结构域特点和基因结构，并和其他植物的GOX基因进行比较分析，初步摸清橡胶树HbGOX1基因的特点。通过qPCR技术分析了该基因在低温胁迫下的表达特征，结果发现HbGOX1基因受低温胁迫的负调控，表明橡胶树在受到低温胁迫时降低了乙醇酸氧化酶基因的表达，因而推测降低了光呼吸途径。另外，由于乙醇酸氧化酶定位到过氧化物酶体中，其产生的过氧化氢最终会被抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）等过氧化物酶所降解[19]，因而HbGOX1基因受低温胁迫的负调控也从另外一个层面表明，乙醇酸氧化酶所催化产生过氧化氢的反应，可能不是橡胶树低温胁迫中活性氧自由基的来源。本研究结果将为研究橡胶树中乙醇酸脱氢酶基因及其所参与的光呼吸途径的生理功能奠定基础。

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