富血小板纤维蛋白、冻干法以及其联合应用研究进展

【摘要】富血小板纤维蛋白（PRF）是一种新型的生物材料，其可促进软硬组织再生的能力已得到国内外学者的认可，而随着科技的发展，冷冻干燥技术也迅速提高，但对于将冻干法与PRF联合应用，将冻干法的优点结合到富血小板纤维蛋白内，目前还尚未有研究报告。本文将就PRF、冻干法以及其联合应用的研究进展进行阐述。

【关键词】 富血小板纤维蛋白；冷冻干燥法

【中图分类号】R-3 【文献标识码】A 【文章编号】1004-4949（2013）06-299-02

1 引言

随着种植技术的飞速发展，人们生活水平的不断提高，及对美观要求的提高，社会对种植的需求量越来越大。但临床上，口腔种植骨缺损仍是难题。2000年，Choukroun等首次发现富血小板纤维蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF），它取自于自体血，不添加任何人工制剂，很好的避免了免疫排斥反应及交叉感染。近年来，对于PRF的研究已经成为一个热点问题，大量文献表明PRF中富含的生长因子，对成骨有显著的影响[1]。但对于这些对成骨有重要作用的生长因子易于流失，无法长期作用于成骨，并且不能长期保存等缺点，仍有待于研究。

冷冻干燥技术最早于1813年由英国人Wollaston发明。1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干保存，取得了较好效果。药品冻干后，可在室温下避光长期贮存，需要使用时，加蒸馏水或生理盐水制成悬浮液，即可恢复到冻干前的状态。与其它干燥方法相比，药品冷冻干燥法具有非常突出的优点和特点。但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知识的交叉和综合，因此仍存在亟待解决的问题[2]。

大量文献表明，冻干后的蛋白质药品可呈疏松多孔状，能长期稳定保存，并且可通过复水从而恢复其活性。根据此特性，冷冻干燥技术已广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物以及药物包埋剂脂质体等药品。但对于将冻干法与PRF联合应用，将冻干法的优点结合到富血小板纤维蛋白内，目前还尚未有研究报告。

2 PRF的结构特点

PRF所含生长因子主要包括：转化生长因子-β（transformation growth factor-β），血小板衍生生长因子-AB（platelet-derived growth factor-AB，PDGF-AB）， 血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）以及胰岛素样生长因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）。PRF的纤维蛋白聚合过程与正常的纤维蛋白网聚合过程类似，形成三分子的立体网状结构，其凝胶组织呈现出疏松、孔隙大、弹性好的特性。这种结构便于营养物质和氧气弥散至细胞周围，为成骨细胞的迁移、增殖及分化提供场所，网状结构还可以为骨愈合提供支架[3]。

2.1 TGF-β超基因家族：

TGF-β1的很多功能有利于骨基质形成和骨化。TGF-β1是骨祖细胞的化学吸引因子，可以刺激成骨细胞的分化和增殖。TGF-β1能抑制破骨细胞的分化、增殖和活化，可有效的使网状骨形成。研究表明，TGF-β1可增加骨连接素和骨桥蛋白表达，降低抑制矿化的骨钙素表达。该家族对其他生长因子的合成尤其是VEGF很重要[4]。

2.2 胰岛素样生长因子 IGF-1：

在骨形成过程中，IGF-1可与成骨细胞上的IGF受体结合，促进Ⅰ型胶原蛋白合成，还可在骨祖细胞和骨基质间起酸化作用，有利于骨矿化。IGF-1可与IGF受体结合，直接作用于破骨细胞，抑制胶原酶的合成[5]。

2.3 血小板衍生生长因子 PDGF：

PDGF是一种促有丝分裂多肽，主要作用于结缔组织细胞。PDGF有很强的趋化成骨细胞和干细胞前体细胞的功能。它还是破骨细胞、成纤维细胞和内皮细胞的活化剂。PDGF有5种亚型，即PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-C及PDGF-D，其由人类血小板中分离出来，体内多种细胞（如骨肉瘤细胞、成骨细胞等）均可分泌和储存[6]。

2.4 血管内皮生长因子 VEGF：

VEGF可增加内皮细胞核内皮前体细胞的趋化和有丝分裂，促进新血管的形成，也可以促进血管舒张和血管通透性，加速血流和运送各种系统生长因子、免疫细胞和流动的干细胞。成骨细胞分泌VEGF和表达其受体，破骨细胞也表达VEGF受体，并且VEGF可聚集破骨细胞到重塑的区域[7]。

3 冷冻干燥原理及特点

冷冻干燥（以下简称冻干）就是将含水物质，先冻结成固态，而后使其中的水分从固态升华成气态，以除去水分而保存物质的方法。在压缩空气干燥过程中，其冷冻干燥是通过降低压缩空气温度，使压缩空气中的水份析出。与其它干燥方法相比，药品冷冻干燥法具有非常突出的优点和特点：a）药液在冻结前分装，剂量准确；b）在低温下干燥，能使被干燥药品中的热敏物质保留下来；c）在低压下干燥，被干燥药品不易氧化变质，同时能因缺氧而灭菌或抑制某些细菌的活力；d）冻结时被干燥药品可形成"骨架"，干燥后能保持原形，形成多孔结构而且颜色基本不变；e）复水性好，冻干药品可迅速吸水还原成冻干前的状态；f）脱水彻底，适合长途运输和长期保存。

虽然药品冷冻干燥具有上述优点，但是干燥速率低、干燥时间长、干燥过程能耗高和干燥设备投资大等仍是该技术的突出缺点。

4 蛋白质冻干损伤及保护机理

药品冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种应力使药品变性，因此，为了保护药品的活性，通常在药品配方中添加活性物质的保护剂。常用的保护剂有如下几类物质：a）糖类/多元醇：蔗糖、葡萄糖等；b）聚合物：葡聚糖、白蛋白等；c）无水溶剂：乙烯乙二醇、甘油、DMSO等；d）表面活性剂；e）氨基酸：谷氨酸钠、丙氨酸等；f）盐和胺：磷酸盐等。

在冻干过程中，由于蛋白质的水合层被除去，优先作用机理不再适用。对于冻干保护机理，仍在研究探讨之中，目前主要有两种：a）水替代假说。由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能替代蛋白质表面的水的羟基，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能的完整性。b）玻璃态假说。在含保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂的结晶不会发生时，保护剂-水混合物就会玻璃化。研究发现在玻璃态下，物质兼有固体和流体的行为，粘度极高，不容易形成结晶，且分子扩散系数很低，因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的链锻运动受阻，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。

目前大部分学者赞同"水替代假说"，因为可以通过实验检测到蛋白质和保护剂之间的氢键，为理论提供证据。事实上，无论是"水替代假说"还是"玻璃态假说"，它们的基础都是基于药液实现了部分或全部玻璃化冻结。

5 结语

随着临床种植患者量的加大，骨缺损病例的增加，如何逆转种植前的骨缺损，提高后期修复的美观性，已经成为临床研究的热点问题。而生物材料的发展在GBR手术中起到了至关重要的作用，将PRF与生物冻干技术结合，预期可得到蜂窝状结构，拥有捕获细胞的功能，并且期望其能降低PRF内生长因子释放速度，以达到促进组织愈合和缓释的功能。

参考文献

[1] Kobayashi M，Kawase T，etc.A proposed protocol for the standardized preparation of PRF membranes for clinical use.Biologicals，2012，40（5）：323-9.

[2] 沈心亮，翟雷，卜晓萍，潘萍，席亮等.冻干神经生长因子活性稳定性试验研究.微生物学免疫学进展，1988，26（3）：54-56.

[3] Pripatnanont P，Nuntanaranont T，Vongvatcharanon S，Phurisat K.The primacy of platelet-rich fibrin on bone regeneration of various grafts in rabbit"s calvarial defects.J Craniomaxillofac Surg.2013，7.

[4] Lundquist R，Dziegiel MH，Agren MS.Bioactivity and stability of endogenous fibrogenic factors in platelet-rich fibrin. Wound Repair Regen.2008，16（3）：356-63.

[5] Lundquist R，Dziegiel MH，Agren MS.Bioactivity and stability of endogenous fibrogenic factors in platelet-rich fibrin. Wound Repair Regen.2008，16（3）：356-63.

[6] Su CY，Kuo YP，Tseng YH，Su CH，Burnouf T.In vitro release of growth factors from platelet-rich fibrin （PRF）： a proposal to optimize the clinical applications of PRF.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.2009，108（1）：56-61.

[7] The use of platelet concentrates： platelet-rich plasma （PRP） and platelet-rich fibrin （PRF） in bone reconstruction prior to dental implant surgery].Rev Med Brux.2010，31（6）：521-7.

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